MCP-1基因-2518A/G位點多態性與2型糖尿病視網膜病變的關系研究

程怡 薛誠 吳金友 林海洋 趙佳佳 毛小潔

隨著2型糖尿病患病人數的增多，疾病本身及其慢性并發癥已成為嚴重的社會負擔。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是2型糖尿病常見的慢性并發癥之一，是發達國家成人致盲的主要原因[1]。多種途徑的炎癥反應損傷血管內皮，是DR的重要發病機制之一[2]。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）屬于趨化因子家族成員，是一種對單核細胞有趨化作用的炎癥細胞因子[3]。有證據表明，MCP-1參與介導感光細胞凋亡和視網膜血管再生[4]。位于MCP-1基因啟動子區的-2518A/G位點多態性會影響MCP-1的表達[5]。基于此，本研究通過聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性分析（PCRRFLP）技術檢測基因多態性，旨在探討MCP-1基因-2518A/G位點多態性與DR的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014至2017年本院收治的2型糖尿病患者192例（DM組），其中男91例，女101例；年齡50～81歲。DM組患者均為中國浙江地區漢族人，相互之間無血緣關系，排除1型糖尿病、伴有急慢性感染性疾病、嚴重心腦血管病變、妊娠、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及因青光眼、白內障和其他眼底血管性疾病等原因導致眼底無法分級者。DM組患者住院期間由專業眼科醫師行眼底檢查及眼底照相。根據2013年中華醫學會眼科學分會眼底病學組的分期方法[6]，將DM組患者分為DR組（93例）和非DR組（99例）；DR組又分為2個亞組，增殖性視網膜病變亞組（PDR亞組，45例）和非增殖性視網膜病變亞組（NPDR亞組，48例）。另擇同期在本院行健康體檢者109例作為對照組，其中男50例，女59例；年齡45～76歲。對照組受檢者均為漢族人，實驗室檢查證實無糖尿病，無高血壓、心臟病、肝臟和腎臟疾病史，且無糖尿病、眼底疾病家族史。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集并記錄DM組患者與對照組受檢者年齡、性別、糖尿病病史及治療史、其他重大疾病史、家族史等，測身高、體重、收縮壓、舒張壓及腰圍，計算BMI；留取血標本，測定空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1C）、C 肽、TC、TG、HDLC、LDL-C等生化指標。

1.2.2 MCP-1基因-2518A/G位點多態性檢測 采用PCR-RFLP技術檢測基因多態性。采用德國QIAGEN公司的DNA提取試劑盒（50T，51104）提取的DM組患者與對照組受檢者外周血白細胞DNA作為模板，聚合鏈式反應上游引物序列5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物序列 5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，擴增產物大小為930bp。反應條件：94℃預變性10min，94℃變性 30s，64℃退火 30s，72℃延伸 30s，上述循環 40次，最后72℃延伸10min。PCR擴增產物以PvuⅡ內切酶（New England Biolabs，US，25 000units，R0151）進行酶切反應，酶切產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后于紫外線成像儀中觀察。由于MCP-1基因-2518A/G位點有PvuⅡ酶切位點，所以AA基因型酶切片段為930bp，AG 基因型為 930、708 和 222bp，GG 基因型為708和222bp。選取經酶切鑒定攜帶不同基因型的PCR產物樣本各1份委托英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，與酶切結果進行對比。

1.3 觀察指標 （1）比較DR組、非DR組和對照組一般情況及生化指標；（2）比較DM組患者與對照組受檢者MCP-1基因-2518A/G位點基因型和等位基因頻率分布情況；（3）分析DR相關危險因素。

1.4 統計學處理 應用SPSS 24.0統計軟件。計算各組的基因型和等位基因頻率分布情況，采用Hardy-Weinberg平衡公式檢驗各組基因型是否達到遺傳平衡。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。DR相關危險因素分析采用logistic回歸。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DR組、非DR組和對照組一般情況及生化指標比較 DR組與非DR組患者年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。DR、非DR組患者年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 均高于對照組受檢者（均P＜0.05）。DR組患者年齡、糖尿病病程均大于非DR組患者（均P＜0.05），而DR組患者與非DR組患者收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、C 肽、TC、TG、HDL-c、LDL-c 比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 DR組、非DR組和對照組一般情況及生化指標比較

2.2 DM組患者與對照組受檢者MCP-1基因-2518A/G位點基因型和等位基因頻率分布情況比較 DM組患者AA基因型頻率為29.2%，高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；DM組患者A等位基因頻率為51.8%，高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。DR、非DR、對照組AA基因型頻率分別為37.6%、21.2%、14.7%，A等位基因頻率為57.0%、47.0%和39.4%，DR組AA基因型頻率高于非DR組和對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），DR組A等位基因頻率高于非DR組和對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。PDR亞組與NPDR亞組MCP-1基因-2518A/G位點基因型頻率和等位基因頻率比較均無統計學差異（均P＞0.05），見表2。

表2 DM組患者與對照組受檢者MCP-1基因-2518A/G位點基因型和等位基因頻率分布情況比較[例（%）]

2.3 DR相關危險因素分析 以DR的發生與否為因變量，選擇MCP-1基因-2518A/G位點基因型、年齡、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、TC、TG、HDL-C 和 LDL-C 為自變量，作 logistic回歸分析，結果顯示，MCP-1基因-2518A/G位點多態性及糖尿病病程與DR的發生有關，AA基因型及糖尿病病程長是DR發生的危險因素，見表3。

表3 DR相關危險因素的logistic分析

3 討論

DR是糖尿病微血管并發癥之一，其發病是由多種因素共同參與、相互作用導致，具體機制尚不十分明確。研究發現，多種炎癥細胞因子和趨化因子參與DR的發病過程，包括血管內皮生長因子、細胞間黏附分子-1和MCP-1等[7-9]。

MCP-1是一種炎癥細胞趨化因子，參與多種在單核細胞及巨噬細胞內發生的反應，包括誘導超氧化陰離子、細胞因子產生和黏附分子表達[9]。在動物試驗中發現，糖尿病大鼠玻璃體、視網膜血管壁和視網膜神經細胞內的MCP-1水平升高，激活視網膜小膠質細胞，釋放炎癥因子，參與DR相關的炎癥反應[10]。葡萄糖和糖化血清白蛋白刺激MCP-1在視網膜色素上皮細胞內的信號表達[11]。此外，還有研究發現眼內的MCP-1水平在DR患者中較高，為對照組的2.2倍[12]。

關于MCP-1基因多態性與DR的相關性研究目前報道不多，且結論并不一致。Jeon等[13]在對590例2型糖尿病患者的研究中發現，MCP-1基因-2518A/G位點AA基因型與PDR的發生有關，而Katakami等[14]及Dong等[15]研究卻認為-2518A/G位點GG基因型及G等位基因增加DR包括PDR的患病風險。本研究以中國浙江地區漢族人為研究對象，比較了DM組和對照組MCP-1基因-2518A/G位點多態性的分布差異。結果表明，DM組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于對照組，提示AA基因型及A等位基因與2型糖尿病易感性有關。該結果與馬江波等[16]研究結果相符。本研究還發現，DR組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于非DR組，logistic回歸分析發現2型糖尿病患者MCP-1基因-2518A/G位點多態性及糖尿病病程與DR的發生有關。

本研究結果反映了浙江地區漢族人MCP-1基因-2518A/G位點多態性與DR的關系，該位點的多態性可能通過影響MCP-1基因的轉錄、翻譯影響視網膜血管表達MCP-1，趨化吸引單核細胞的聚集從而引起毛細血管的阻塞，同時誘導多種途徑的炎癥反應損傷血管內皮，最終導致DR的發生。本研究結果與目前已知的國內外研究結果并非完全一致的原因可能有：首先，該基因位點突變存在種族差異性，基因型及等位基因的頻率在各項研究中并不一致；其次，部分其他研究樣本的糖尿病病程較短，各組間血糖水平存在差異，本研究中DR組和非DR組糖尿病病程均較長（平均病程＞10年），而兩組間血糖水平無統計學差異；但是本研究樣本量不夠大（301例）可能也是造成結果偏差的原因。

綜上所述，本研究結果顯示MCP-1基因-2518A/G位點多態性與2型糖尿病患者DR發生有關，其中AA基因型可能是浙江局部地區漢族人群中2型糖尿病患者發生DR的危險因素，A等位基因可能增加該人群DR的發生風險。但由于DR的發生、發展是多種遺傳和環境因素共同作用的結果，進一步研究MCP-1基因與其它基因以及環境因素等的相互影響有助于深入揭示DR發生的病理生理機制。