蛹蟲草多糖硫酸化修飾及抗氧化研究

李婧婧 李爽 劉靜雪 李鳳林

【摘要】采用醇沉法結合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲草中性精多糖級份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法對PCm進行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖（SPCm）。紫外光譜分析顯示，SPCm在260nm附近有一個硫酸酯基特征吸收峰，說明已形成了硫酸化多糖。SPCm具有良好的抗氧化性，對DPPH自由基與超氧陰離子自由基均具有清除作用。

【關鍵詞】蛹蟲草 多糖 硫酸化修飾 抗氧化

1材料與方法

1.1材料與試劑

蛹蟲草子實體，由吉林市匯豐科技公司提供;無水甲酰胺、氯磺酸、吡啶、氫氧化鈉溶液、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、氯化鋇、明膠、咔唑、半胱氨酸、鹽酸、葡萄糖、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、DEAE-纖維素、氮藍四唑（NBT）、還原型輔酶（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）、2，6-二叔丁基對甲苯酚（BHT）等均為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1蛹蟲草多糖的提取。將干蛹蟲草進行粉碎，過60目篩，粉末按30：1料液比加入水，80℃提取2h、離心10 min，取上清液，沉淀再重復提取3次，，合并上清液并過濾濾液，用旋轉蒸發器濃縮到原體積1/5，然后以4︰1（v/ v）的比例加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h）、離心，沉淀依次無水乙醇、丙酮洗滌，干燥后獲得粗多糖組份。

1.2.2蛹蟲草多糖的純化。蛋白質的去除選擇Sevag法。準確稱取蛹蟲草粗多糖0.5g，加蒸餾水溶解至100 mL，加入Sevag試劑搖勻反應12 min，離心除去蛋白層，反復多次，直至完全去除。濾液加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h），離心，沉淀用75%乙醇反復洗滌2次，獲得去蛋白后粗多糖。向去除蛋白的粗多糖溶液中加入氨水，調pH=8.5，然后滴加H2O2，溫度控制在40℃保溫，混均后會看到溶液顏色發生變化，至橙黃色時，停止滴加氨水和H2O2，靜置4h后，減壓濃縮，醇析，真空干燥后保存備用。將脫色粗多糖溶于蒸餾水中制成5 mg/mL多糖溶液，上DEAE-纖維素柱，用蒸餾水按1.0 mL/min速度洗脫，每管，測每管（10 mL）多糖含量。將小峰去除，只收集最大峰，溶液經蒸餾水進透析袋透析48 h、干燥后得蛹蟲草中性精多糖級份（polysaccharide from Cordyceps militaris，PCm）。

1.2.3硫酸酯化多糖的制備。將100mg PCm懸浮于10mL無水甲酰胺中，室溫攪拌15min，隨后加入2mL硫酸化試劑（氯磺酸和不同硫酸化反應溶劑混合，比例按1﹕4配比）。在連續攪拌下將混合物在室溫下保持2h，然后在30℃保溫5 h。迅速冷卻至室溫后，用15%NaOH溶液中和，透析，濃縮并干燥，得到硫酸化多糖（Sulfation polysaccharide from Cordyceps militaris，SPCm）。

1.3實驗設計

1.3.1硫酸化反應的溶劑選擇：為確定適合的反應溶劑，參考已知文獻，以取代度為指標，選吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO為酯化反應溶劑。

1.3.2紫外光譜分析：將PCm及SPCm加蒸餾水按1mg/mI濃度溶液，選取在190～400nm的波長進行紫外光譜分析，獲得紫外光譜圖。

1.3.3抗氧化能力確定：

（1）1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力。將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。用移液槍吸取1.0 mLSPCm加入2mL DPPH溶液（6.0mg DPPH溶解在100mL中甲醇），空白對照采用1.0 mL甲醇加入2mL DPPH溶液。緩慢搖晃使其混合均勻，室溫條件下避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對照，平行三次，取平均值。DPPH自由基的清除能力根據以下公式計算： 。式中：As-樣品吸光度;A1 -空白對照的吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

（2）超氧陰離子自由基（02-·）清除能力。首先將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。采用NBT-NADH-PMS方法測定超氧陰離子自由基。樣品管中依次加入1.0mL的NBT溶液（pH7.4），1.0mLNADH溶液（pH7.4）和0.1mL樣品溶液，再加入100μL PMS溶液，室溫反應5 min，在560nm處測定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對照，平行三次，取平均值。

DPPH自由基的清除能力根據以下公式計算： 。式中：A-樣品吸光度;Ac -蒸餾水替代吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

1.4分析測定方法

采用苯酚-硫酸比色法測定多糖，采用氯化鋇-明膠比濁法測定取代度，計算公式如下：取代度（DS）=1.62/（32-1.02）S×100。式中：S-樣品中硫酸根質量分數（%）。

2結果與分析

2.1不同反應溶劑對蛹蟲草硫酸化多糖取代度的影響

選擇吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲酰胺和二甲基亞砜（DMSO）作為反應的溶劑，其對蛹蟲草硫酸化多糖（SPCm）取代度的影響見圖1。圖1可以看出，以吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO作為反應溶劑獲得對蛹蟲草硫酸化多糖的取代度依次為1.22、1.17、0.86、0.43。因此選擇吡啶作為反應最佳溶劑。其原因可能DMF、甲酰胺、DMSO極性都比吡啶弱，所以硫酸化衍生物的取代度都不大。

2.2蛹蟲草硫酸化多糖紫外光譜分析

蛹蟲草硫酸化多糖（SPCm）的紫外光譜見圖2，蛹蟲草多糖（PCm）的紫外光譜見圖3.圖2、圖3可以看出，SPCm與PCm在220nm附近均有多糖的特征吸收峰;SPCm在260nm附近有一個硫酸酯基特征吸收峰，說明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發生輕微位移不明顯，說明多糖在硫酸化過程中基本沒降解較。

2.3蛹蟲草硫酸化多糖對DPPH自由基的清除作用

實驗結果顯示在0-0.2mg/mL劑量范圍內，SPCm的DPPH自由基清除活性弱于BHT，但在不斷增加的濃度下，RAP的清除作用迅速趕上并超過BHT。濃度為0.25mg/mL時，SPCm與BHT的清除活性為的86.89%和80.45%。即SPCm對DPPH自由基具有良好的清除活性。

2.4蛹蟲草硫酸化多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

通過實驗結果發現SPCm和BHT的超氧陰離子自由基清除活性隨著其濃度的增加而增加。在0.25mg/mL時，SPCm和BHT顯示74.62%和83.35%的清除活性，BHT比SPCm更有效。 結果表明，SPCm對超氧陰離子自由基具有較高的清除活性，但低于BHT。

3結論

采用醇沉法結合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲草中性精多糖級份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法對PCm進行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖（SPCm），獲得以下結果：

（1）吡啶作為反應溶劑獲得對蛹蟲草硫酸化多糖的取代度最高，是反應最佳溶劑。氯磺酸一吡啶法是多糖硫酸化最理想的一種方法。

（2）糖紫外光譜分析顯示，SPCm在260nm附近有一個硫酸酯基特征吸收峰，說明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發生輕微位移不明顯，說明多糖在硫酸化過程中基本沒降解。

（3）SPCm對DPPH自由基具有良好的清除活性。

（4）SPCm對超氧陰離子自由基具有較高的清除活性，但低于BHT。

基金項目：1.吉林農業科技學院大學生科技創新創業計劃項目《蛹蟲草的多糖硫酸化修飾及抗氧化研究》[吉農院合字（2018）第040號]2.吉林省教育廳十三五科技項目《蛹蟲草多糖硫酸化修飾及其生物活性研究》[JJKH20180732KJ]。

第一作者簡介：李婧婧，女（漢），吉林人，吉林農業科技學院食品工程學院食品科學與工程專業2016級本科生。通訊作者：李鳳林（1973-），男（漢），吉林人，研究方向：食品營養與分析。