基于正相高效液相色譜法的S-奧拉西坦在比格犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

孫文霞， 楊 晨， 榮祖元， 葉 雷， 賀 英， 程 強(qiáng)

(1.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610052；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院， 四川 成都 611731； 3.重慶東澤醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司， 重慶 400042)

0 引 言

奧拉西坦(Oxiracetam，ORT)，化學(xué)名為4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，能夠促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺的合成和腦代謝，并能通過(guò)血腦屏障對(duì)特異性中樞神經(jīng)道路起刺激作用，從而改善智力和記憶[1].從ORT的結(jié)構(gòu)式(圖1)可見，其在吡咯環(huán)上引入了一個(gè)羥基，形成一個(gè)手性中心，因而存在光學(xué)對(duì)映體，即S-奧拉西坦(S-ORT)和R-奧拉西坦(R-ORT).相關(guān)文獻(xiàn)表明，S-ORT對(duì)改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力以及認(rèn)知功能障礙的效果優(yōu)于ORT.目前，已有學(xué)者報(bào)道了ORT異構(gòu)體的分離測(cè)定方法以及S-ORT靜脈注射后在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化情況[2-3].對(duì)此，本研究建立了正相高效液相色譜法(NP-HPLC)同時(shí)測(cè)定2種異構(gòu)體的濃度，并對(duì)S-ORT口服給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)等相關(guān)情況進(jìn)行了分析.

圖1奧拉西坦的結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：S-ORT對(duì)照品(批號(hào)，091204-R，含量為100.4%)、R-ORT對(duì)照品(批號(hào)，20160121，含量為99.86%)，購(gòu)自成都百途醫(yī)藥科技有限公司；吡拉西坦(批號(hào)，100386-200702)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、正己烷均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；無(wú)水乙醇為色譜純(含量為99.8%)，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司.

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物包括：比格犬18只，雌雄各半，7～8月齡，體重6～8 kg，四川養(yǎng)麝研究所比格犬繁育中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)，SCXK(川)2014-01).實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物檢疫和馴化飼養(yǎng)4周.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Sartorius CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XW-80A型渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)；ZLS-1型真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱為Daicel CHIRALPAK ID手性分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為正己烷∶乙醇(80∶20)；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL.

2.1.2 溶液的制備.

分別精密稱取S-ORT和R-ORT對(duì)照品適量，用50%甲醇配制成含S-ORT和R-ORT均為4 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃下保存，臨用時(shí)用50%甲醇配制成含R-ORT和S-ORT各為2.00、1.00、0.40、0.20、0.10、0.04、0.02 mg/mL的系列工作對(duì)照品溶液.

取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，精密稱定，用50%甲醇配成終濃度為1.25 mg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃下保存待用.

2.1.3 血漿樣品前處理.

取血漿樣品200 μL，置1.5 mL具塞離心管中，加入50%甲醇20 μL，內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，振蕩混勻30 s，加入600 μL 甲醇，漩渦振蕩1 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液600 μL，置真空離心濃縮儀中50 ℃揮干，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，過(guò)濾，吸取20 μL進(jìn)樣分析.

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 專屬性.

按“2.1”項(xiàng)下方法，分別測(cè)定犬空白血漿、犬空白血漿加S-ORT與R-ORT以及內(nèi)標(biāo)對(duì)照品、犬口服S-ORT后的血漿樣品，其色譜圖見圖2.結(jié)果表明，S-ORT、R-ORT和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為14.9、10.7和12.9 min，犬血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾3者的測(cè)定.

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限.

取犬空白血漿200 μL，加入ORT對(duì)照品系列工作溶液20 μL，配制成相當(dāng)于S-ORT和R-ORT終濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的模擬血漿樣品，不加入50%甲醇，其他步驟按“2.1”項(xiàng)下方法.以待測(cè)物S-ORT或R-ORT的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，經(jīng)加權(quán)(W=1/C)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，R-ORT和S-ORT的回歸方程分別為，Y=-0.015+0.018C，R=0.995和Y=-0.022+0.018C，R=0.996.

圖2 S-ORT、R-ORT和內(nèi)標(biāo)的HPLC色譜圖

結(jié)果表明，兩者的線性范圍均為2.0～400.0 μg/mL，最低定量限均為2 μg/mL.

2.2.3 精密度與準(zhǔn)確度.

取犬空白血漿200 μL，按“2.2.2"項(xiàng)下方法，制成含R-ORT和S-ORT濃度分別為4.0、40.0、200.0 μg/mL 3個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每一濃度做平行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，并根據(jù)每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品中R-ORT和S-ORT的濃度，同時(shí)計(jì)算批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1.結(jié)果表明，R-ORT與S-ORT血漿樣品的批內(nèi)、批間精密度(RSD)均小于15%，方法符合生物樣品測(cè)定要求.

表1 S-ORT和R-ORT在血漿中的精密度和準(zhǔn)確度(n=6)

2.2.4 穩(wěn)定性.

取犬空白血漿200 μL，按“2.2.2"項(xiàng)下方法，制成含R-ORT和S-ORT濃度分別為4.0，40.0，200.0 μg/mL 3個(gè)濃度的QC樣品，每一濃度配制3份.分別考察-80 ℃反復(fù)凍融3次、室溫下放置8 h、-80 ℃下冷凍15 d以及處理后的樣品在進(jìn)樣池(5 ℃)中放置24 h后的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，3次凍融的回收率為90.14%～107.25%，在室溫放置8 h的回收率為91.96%～110.32%，-80 ℃下儲(chǔ)存15 d的回收率為90.37%～113.28%，處理后的樣品在進(jìn)樣池中(5 ℃)放置24 h的回收率為95.41%～107.83%，RSD小于10.15%.結(jié)果表明，方法穩(wěn)定性良好.

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 給藥及樣品采集.

取18只比格犬，隨機(jī)分為3個(gè)劑量組，每組6只，雌雄各半.S-ORT單次灌胃給藥，劑量分別為50 mg/kg、150 mg/kg、450 mg/kg，給藥前禁食12 h，給藥后禁食4 h，自由飲水.自下肢小隱靜脈采集給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24 h血樣2.5 mL，置肝素化EP管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-80 ℃保存，待測(cè).

2.3.2 藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理.

按“2.1.3"項(xiàng)下方法同時(shí)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)樣品中R-ORT和S-ORT的濃度.運(yùn)用DAS 2.1軟件(中國(guó)藥理學(xué)會(huì))計(jì)算2者的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù).結(jié)果顯示，高、中、低3個(gè)劑量組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中均未檢測(cè)出R-ORT.此說(shuō)明，S-ORT經(jīng)口給藥后在犬體內(nèi)未發(fā)生明顯的手性轉(zhuǎn)化.低、中、高3種劑量S-ORT灌胃給藥后，其在比格犬體內(nèi)的平均血藥濃度隨時(shí)間變化過(guò)程符合一室模型.

S-ORT的血藥濃度—時(shí)間曲線如圖3所示，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括，達(dá)峰濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、半衰期(t1/2)、表面分布容積(V)、消除率(Cl)以及平均血藥濃度—時(shí)間曲線下面積(AUC(0～24 h))，見表2.

圖3 S-ORT在犬體內(nèi)的平均血藥濃度—時(shí)間曲線(n=6)

表2 犬口服S-ORT后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

目前，檢測(cè)ORT的方法有液質(zhì)聯(lián)用法[4-7]和HPLC法[8-9]等，而對(duì)ORT異構(gòu)體進(jìn)行拆分需采用手性分析柱，并以正己烷、異丙醇及乙醇正相系統(tǒng)等為流動(dòng)相.若采用液質(zhì)聯(lián)用法，由于流動(dòng)相中沒(méi)有可以提供質(zhì)子的化合物或者基團(tuán)，因而不能采用液質(zhì)聯(lián)用電噴霧質(zhì)譜法(HPLC-ESI-MS)，換用大氣壓力化學(xué)電離源(APCI)則要采用電暈針輔助電離，流動(dòng)相全是有機(jī)相，有著火的危險(xiǎn)，因而液質(zhì)聯(lián)用法不可行.

在文獻(xiàn)[10]中，其采用正己烷∶乙醇∶三氟乙酸(78∶22∶0.1)為流動(dòng)相，本研究對(duì)正己烷、乙醇以及三氟乙酸的比例進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在不加入三氟乙酸，采用正己烷與乙醇的比例為80∶20時(shí)，ORT異構(gòu)體與內(nèi)標(biāo)之間的分離度符合要求，且峰形良好.另外，采用甲醇按3∶1的比例處理血漿樣品，沉淀后的上清液含有一定比例的水，不能直接進(jìn)樣分析，否則會(huì)破壞正相系統(tǒng)，不能正常出峰.因而需要采用氮?dú)獯蹈捎眉状蓟蛄鲃?dòng)相復(fù)溶后，再進(jìn)樣分析，同時(shí)這種方法還可以提高測(cè)試靈敏度.

本研究表明，S-ORT口服給藥后，低、中、高3個(gè)劑量的Tmax分別為1.62±1.15、1.31±0.63、1.80±0.51 h，不隨劑量變化；Cmax分別為48.63±14.13、99.57±38.25、184.62±47.63 μg/mL，AUC0-t分別為129.74±42.26、378.13±131.08、872.60±175.321 μg·h/mL，說(shuō)明Cmax和AUC0-t隨劑量增加而增加，呈線性相關(guān)性.在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到R-ORT，說(shuō)明S-ORT口服給藥后，在犬體內(nèi)無(wú)明顯的變旋現(xiàn)象，與人體注射給藥的結(jié)果一致.