釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣仿生礦化牙齒性能研究

董志紅, 陳 渝, 宋慧謹, 周長春, 盧志龍, 李 旭

(1.成都大學 機械工程學院, 四川 成都 610106；2.四川大學 國家生物醫學工程研究中心， 四川 成都 610064)

0 引 言

隨著材料學、分子生物學和基礎醫學等交叉學科的發展，通過生物活性材料在體內刺激細胞(干細胞)使其遷移、增殖、分化、誘導，使自身的組織進行再修復以及重建受損組織或器官，已成為該領域研究的熱點.20世紀70年代，科研人員就發現了生物玻璃粉體(CaO-SiO2-P2O5)材料，該種材料具有特有的生物活性，可與人體活骨組織產生牢固的化學結合，植入人體后與組織界面區域不會形成非黏連性纖維層隔膜，進一步的研究也證實了生物玻璃作為骨修復材料長期植入體內對成骨細胞沒有毒性，能促進成骨細胞的增殖，加速新骨的生成，并和骨形成牢固的鍵合，可修復受損的骨組織和牙缺損，獲得了較好的臨床應用效果[1-5].氟是人體中的一種必需微量元素，主要分布在骨骼、牙齒、指甲和毛發中，對骨骼和牙齒硬組織的生長起著重要作用.牙齒中含微量的氟，可促進磷灰石在牙釉質表面沉積，加速釉面再礦化，提高結晶度[6].研究證實，氟基磷灰石比羥基磷灰石晶體表面積更小，使牙齒比人體骨更加堅固，可提高外來物質的侵蝕[7].常規的氟元素，在日常牙齒保護中，常以單純的氟離子存在，如氟化鈉.但牙齒中釋放過多的氟離子，會減少釉質蛋白的分泌，干擾成釉細胞的調控機制，減少釉基質絲氨酸蛋白酶的合成和分泌，最終導致氟牙癥的發生[8].且這些氟離子，不能和其他元素形成活性物質誘導磷灰石的形成，也就不能修復受損的牙組織.而釉原蛋白，在牙釉質形成階段，可自行組裝，調控牙釉質晶體的有序生長和排列，形成納米晶，從而使牙齒更加堅固.本研究擬采用氟基硅酸鈣，在釉原蛋白誘導下，在仿生礦化液中對牙齒進行仿生礦化，在其表面形成一層致密的礦化層，并分析該礦化層的結構和晶體形態，對其力學性能進行評估及生物學表征，以獲得最佳的仿生牙釉質.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實驗所用的牙釉質小片為臨床上因正畸而拔掉的成人恒牙，用切割機去除根部，牙冠超聲清洗，縱向切割成3 mm×3 mm×2 mm大小的牙釉質樣品，然后進行拋光處理，再經乙醇溶液超聲波清洗后，烘干備用.

實驗所用試劑包括：硅酸鈉(Na2SiO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、氟化銨(NH4F)、氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、三水磷酸氫二鉀(K2HPO4· 3H2O)、 六水氯化鎂(MgCl2· 6H2O)、 鹽酸(HCl)、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)、十水硫酸鈉(Na2SO4·10H2O)，均購自成都科龍化工試劑廠；三羥甲基氨基甲烷(HN2C(CH2OH)3)，購自Sigma公司；RPMI-1640培養基，購自Gibco公司.

1.1.2 儀 器.

實驗所用儀器包括：PW2404型X射線光電子能譜儀(飛利浦公司)；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡(徠卡儀器有限公司)；Infinite200 Pro型多功能酶標儀(帝肯(上海)貿易有限公司)；JSE-5900LV型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；HV-1000型顯微維氏硬度計(上海比目儀器有限公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 氟基硅酸鈣制備.

1.2.2 仿生礦化液配置.

1.2.3 實驗流程.

實驗流程為：將處理好的牙釉質小片清洗干凈后備用，將配置好的檸檬酸(pH=4.2)置于容量瓶中，將牙釉質小片酸蝕30 s后，用清水沖洗，然后用小牙刷蘸取氟基硅酸鈣粉體在牙釉質表面輕輕刷涂，模擬刷牙的形式，刷1 min后，用清水沖洗；取配置好的仿生礦化液，將0.2 μg豬釉原蛋白(P173)溶液滴定到礦化液中，調節pH值到7.4～7.6，再將上述處理的牙釉質小片放在溶液中，置于37.2～37.6 ℃恒溫水浴箱中振蕩浸泡24～48 h，獲得仿生礦化材料層.實驗對照樣為未加釉原蛋白的礦化液處理樣.實驗材料的仿生礦化流程如圖1所示.

圖1氟基硅酸鈣在誘導牙齒仿生礦化的流程

1.3 材料表征

在材料表征中，氟基硅酸鈣材料的成分通過X射線光電子能譜儀測定；仿生礦化層的顯微結構通過掃描電子顯微鏡觀察，并通過X射線能譜分析(EDX)測試礦化層的主要成分比;礦化層的力學性能通過顯微維氏硬度計測定，測定5個樣品，取平均值.

1.4 細胞實驗

在常規的體外細胞培養實驗中，將經仿生礦化處理的牙釉質小片，用70%酒精消毒15 min后，再通過紫外光照30 min殺菌消毒后備用，然后將樣品放在培養皿中，與骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在體外共培養1、2、3 d.細胞培養液的成分為RPMI-1640與10%胎牛血清(FCS)，將100 μL含細胞大約為1×106個/mL的培養液直接種植在各個試樣中(試樣置于96孔細胞培養板中)，經過24 h后細胞附著在試樣上，然后再往試樣上添加2mL的培養液，之后將試樣放置在37 ℃，5% CO2的環境下進行細胞培育，并且每24 h換一次培養液.

為了觀察細胞的貼壁及生長情況，本研究使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞增殖及分化等，并通過多功能酶標儀計算細胞的生物活性.

2 結果與分析

2.1 仿生礦化層的顯微結構

試樣的仿生礦化層的顯微結構如圖2所示.

由圖2可知，試樣經過氟基硅酸鈣處理后，在牙釉質表面形成了一層礦化層(見圖2(a))，呈納米多層狀的短柱狀納米晶粒團聚體，且中間有微孔隙，孔徑大小為2～20 nm，粒徑大小為30～80 nm.而試樣經過氟基硅酸鈣處理后，在釉原蛋白誘導下的礦化液中，牙釉質表面形成簇狀短棒狀結晶(見圖2(b))，結構類似于牙釉質的納米磷灰石，且按一定方向有序簇狀生長.進一步分析可知，2個樣品的材料表面化學成分也類似，在較短實驗時間內礦化層的鈣磷比(1.42)接近于牙釉質鈣磷比(1.45).事實上，釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣形成的仿生礦化結構，與很多因素有關，如理化條件、pH值等，且釉原蛋白中的一種異形體具有信號分子作用，能夠改變細胞的表達，促進骨細胞的分化和牙周組織的再生.形成的有序的短棒狀簇狀結構，主要是釉原蛋白的磷酸化基團對自組裝形成高度有序的結構具有潛在的影響[10].磷酸化基團的疏水結構通過pH值、溫度及生理條件來調節，控制其離子強度和釉原蛋白的結構，并進一步加強蛋白質和蛋白質、蛋白質和礦物質的相互作用.同時，磷酸化基團的低溶解性易形成聚集物，并以固態或凝膠狀形式存在，這種溶解和未溶解的釉原蛋白共存在早期的釉質礦化中，可形成“納米球"，為晶體的發生和成長方向提供了有機的微觀結構[11].因此，釉原蛋白誘導礦化過程中，調控牙釉質的礦物質形成，且它與鈣離子較強的親和性使其對礦物的形成具有促進和抑制的雙重調節功能，從而影響特定晶面發生擇優取向，影響礦物的形核和形貌.在釉質晶體形成的早期階段，釉原蛋白的濃度等因素影響著磷酸八鈣(OCP)的晶體結構，導致其晶體沿著c 軸快速生長，形成有序化的礦化相.

圖2仿生礦化層顯微結構及對應的Ca/P比

2.2 力學性能測試

通常，正常牙齒的維氏硬度值在240～350之間[12].本研究試樣的牙釉質仿生礦化層力學結果如圖3所示.

FCS為氟基硅酸鈣處理； A-FCS為釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣處理

圖3仿生礦化層的力學性能對比

由圖3可知，單純的氟基硅酸鈣(FCS)在仿生礦化液中誘導形成的礦化層力學性能,處理5 d后，其維氏硬度為290±10.而釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣(A-FCS)在礦化液中，5 d后所形成的礦化層，其維氏硬度為320±10，力學性能優于單一氟基硅酸鈣材料仿生所形成的礦化層.

2.3 細胞結果

牙釉質試樣小片經過仿生礦化處理24 h后，消毒，與骨髓間充質干細胞(MSCs)在體外共培養24、48、72 h后，其激光共聚焦顯微鏡圖片如圖4所示.

FCS為氟基硅酸鈣； A-FCS為釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣

圖4牙釉質小片經過仿生礦化后，與骨髓間充質干細胞

(MSCs)體外培養不同時間(a)及在48h細胞的活力(b)

由圖4可知，材料體外細胞培養結果隨著時間的延長，細胞逐漸增殖、分化，表現出良好的生物相容性與促進細胞增殖能力(見圖4(a)).與單一的氟基硅酸鈣材料(FCS)相比，釉原蛋白誘導下的氟基硅酸鈣材料(A-FCS)細胞數量增加，密度較大，且細胞活力均較好(見圖4(b)).實驗結果表明，材料的表面結構對細胞的增殖與分化有一定的影響，但兩種礦化結構均表現出較好的生物相容性.

3 結 論

本研究表明，釉原蛋白誘導氟基硅酸鈣，采用正常的理化條件，如口腔的pH值和溫度等，在仿生礦化液中誘導晶體生長可形成仿生礦化層，其結構類似于正常的牙齒的結構，晶格有序排列且能等定向生長，力學性能較好，且仿生礦化層具有較好的生物相容性，細胞可貼壁生長，且增殖分化.本研究方法可構建微納米結構的釉質組織，并修復受損的牙齒及促進其再生.下一步的動物模型需要進一步評估該材料在牙槽骨中誘導釉質的生成.