復配天然果汁清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺效果的研究

閆妍，王瑞，康宏偉，楊穎晗，熊鳳嬌，馬儷珍

（天津農學院 食品科學與生物工程學院，天津300384）

在肉制品加工過程中，通常會加入一種食品添加劑亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的添加可以不僅改善肉制品色澤，增進肉制品的風味，同時可以起到一定的抑菌的作用，可以有效抑制肉制品中肉毒梭狀芽孢桿菌的生長，防止肉制品腐敗變質從而達到延長食品保藏期的效果。亞硝酸鹽本身無致癌性，但是亞硝酸鹽可以和胺類物質，特別是二級胺類物質發生反應形成致癌物N-亞硝胺[1-4]，因此控制食品中的亞硝酸鹽及N-亞硝胺類化合物很有必要。亞硝酸鹽作為食品添加劑，尤其在肉制品加工中起著重要作用，研究者目前還沒有找到能夠完全替代它的食品添加劑，但尋找有效的亞硝酸鹽清除劑以及亞硝化抑制劑早已成為眾多學者的研究熱點[5-6]。

近年來，國內外學者利用含有黃酮化合物、茶多酚、花色苷、VC等活性成份的天然產物來清除亞硝酸鹽或阻斷亞硝胺的合成，效果明顯[7-15]。本研究選用6種天然產物，葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜。研究表明，葡萄中含花青素、原花青素等多種酚類物質[16]，檸檬中含多種多酚、黃酮類物質、檸檬苦素等多種活性物質[17]，石榴中含有豐富的VC等營養成分[18]，菠蘿中含豐富的多糖有較強的抗氧化效果[19]，木瓜中含黃酮等多種活性成分[20]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，研究天然果汁清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的效果，優選出效果最佳的復配比例，并最終確定天然果汁用量及復配方式，為尋求有效的亞硝酸鹽的清除劑和亞硝胺合成的阻斷劑提供理論依據。目前，有關這方面的研究，國內尚未有報道。由于肉制品安全問題被越來越多的國家所重視，本研究對于控制食品中N-亞硝胺類化合物及提高食品安全性方面有著實際意義[21-24]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜：市購。

1.1.2 試劑

檸檬酸鈉、濃鹽酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉、1-萘胺、無水對氨基苯磺酸（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T6-1650E紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋：上海科恒實業發展有限公司；Z36HK高速冷凍離心機：賀默（上海）儀器科技有限公司；A11艾卡分析用研磨機：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；NuAire NU-543二級A2型生物安全柜（II級A2）：天美（中國）科學儀器有限公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮果汁的制備

參考宋爽等[25]的研究結果，用直接榨汁法提取的果蔬汁液對亞硝酸根的清除效果優于超聲法和水浴法。因此選用直接榨汁法制取新鮮果汁：新鮮水果挑選→去除果皮和籽→切成小塊→清洗→榨汁機榨汁→離心→取上清液作為提取液→4℃冷藏備用。

1.3.2 天然產物提取液對亞硝酸鹽的清除作用[26]

1.3.2.1 亞硝酸鹽清除率的測定原理

當加入提取液時，提取液與亞硝酸鈉作用將部分亞硝酸鈉消耗掉，剩余亞硝酸根在酸性條件下，可以是對氨基苯磺酸重氮化，再使其與1-萘胺偶合生成紅色化合物，用分光光度計測出該化合物的吸光度值可計算上述反應液中亞硝胺含量。

1.3.2.2 操作步驟

取10 mL離心管，加入0.1 mL提取液，5 mL，0.5 mol/L的pH值為3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液，再加入0.5 mL，1 mmol/L的亞硝酸鈉，將反應體系用緩沖液定容到10 mL，在37℃條件下保溫反應30 min，取1 mL于5 mL試管中加入1%對氨基苯磺酸和0.1%的1-萘胺各1.5 mL，定容至5 mL，放置15 min顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.3.2.3 單因素亞硝酸鹽清除率的測定

用已得到的葡萄、黃檸檬、青檸檬、石榴、菠蘿、木瓜6種天然產物提取液進行不同質量分數提取液對亞硝酸鹽清除率的測定。加入各提取液的添加量分別0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%時，按上述操作步驟進行測定，并計算各個質量分數下提取液的阻斷率，進行分析。

1.3.3 清除亞硝酸鹽正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗，選擇黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產物進行復配，得到9組不同提取液濃度組合的復配試驗組。具體正交試驗設計因素水平設計見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.3.4 天然產物提取液對亞硝胺的阻斷作用

1.3.4.1 亞硝胺阻斷率的測定原理

參照郭艷華等[27]的測定原理進行測定。

1.3.4.2 操作步驟

參照馬儷珍等的方法略有修改[28]。取10 mL離心管，加入0.5 mol/L，pH3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液5 mL，加入1 mmol/L的二甲胺鹽酸鹽0.5 mL，然后將反應體系用緩沖液定容到10 mL，于37℃保溫反應1 h。反應結束后，取1 mL經反應的溶液置于5 mL的試管中，加入0.5 mL質量分數0.5%的碳酸鈉溶液，于15 W紫外燈照射15 min，紫外燈距離液面45 cm。取出后加入質量分數1%的對氨基苯磺酸和質量分數0.1%的1-萘胺各1.5 mL，加入蒸餾水使溶液體積精確為5 mL。放置15 min顯色后在波長525 nm比色測定其吸光度。

1.3.4.3 單因素亞硝胺阻斷率的測定

在清除亞硝酸鹽試驗研究的基礎上，用上述試驗選出的黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產物進行不同質量分數提取液對亞硝胺合成阻斷率的測定。加入各提取液的添加量分別 0、1%、5%、10%、20%、30%時，按上述操作步驟進行測定，并計算各個質量分數下提取液的阻斷率，進行分析。

1.3.4.4 阻斷亞硝胺正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，用黃檸檬、菠蘿、木瓜3種天然產物最佳復配比正交試驗，得到9組不同提取液濃度組合的復配試驗組。具體正交試驗設計因素水平設計見表2。

表2 正交試驗設計因素水平表Table 2 Coded and actual levels of three antioxidants for orthogonal array design

1.4 計算

1.4.1 亞硝酸鹽清除率的計算方法

式中：A1為蒸餾水代替天然產物提取液的空白對照組吸光度；A2為加入提取液按照標準操作步驟測得的吸光度。

1.4.2 亞硝胺阻斷率的計算方法

式中：A0為蒸餾水代替天然產物提取液的空白對照組吸光度；AX為加入提取液按照標準操作步驟測得的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素亞硝酸鹽清除率的測定

不同質量分數的各種天然產物提取液對亞硝酸鹽的清除率如圖1所示。

圖1 不同質量分數提取液的亞硝酸鹽清除率Fig.1 Different concentrations of the extract for the eliminating of nitrite

由圖1可見，菠蘿提取液質量分數在0%～1%范圍內變化時，對N-亞硝胺的阻斷率范圍為0%～52.1%，且當其質量分數達到1%時，阻斷率最高達到了52.1%。當質量分數繼續升高時，阻斷作用有趨于平緩逐漸減小的趨勢。同樣，黃檸檬、木瓜、青檸檬、石榴、葡萄提取液均在質量分數為1%時達到最佳阻斷效果。同時由圖1可以看出，菠蘿清除亞硝酸鹽的效果最明顯，其次是黃檸檬和木瓜。這3種天然產物提取液對亞硝酸鹽清除率始終高于青檸檬、石榴和葡萄，由此根據單因素試驗篩選出菠蘿、黃檸檬、木瓜這3種清除亞硝酸鹽效果較強的天然提取物，且根據單因素試驗結果可知，清除亞硝酸鹽最佳質量分數為1%。

2.2 亞硝酸鹽清除作用最佳復配比的選擇

按正交試驗設計因素水平表1，最佳復配比正交試驗結果見表3。

表3 最佳復配比正交試驗設計及結果Table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

續表3 最佳復配比正交試驗設計及結果Continue table 3 The design and the results of the orthogonal experiment

從9個處理中直觀地找出最優水平組合為5號處理，即A2B2C1，試驗指標值為79.5%；通過正交試驗結果的統計分析，得出最優水平組合為A2B2C1，與選出的5號處理結果吻合。經進一步試驗檢驗得出，最優水平組合為A2B2C1，即黃檸檬提取液質量分數為1.0%，菠蘿提取液質量分數為1.0%，木瓜提取液質量分數為0.8%，混合果汁對亞硝酸鹽清除效果最好，清除率為79.5%，比單因素試驗中最高清除率52.1%（菠蘿）明顯提高，天然產物提取液復配得到的果汁對亞硝酸鹽清除效果最理想。

2.3 單因素亞硝胺合成阻斷率

各提取液的質量分數分別0、1%、5%、10%、20%、30%時對亞硝胺合成的阻斷率見圖2。

圖2 不同質量分數提取液的亞硝胺阻斷率Fig.2 Different concentrations of the extract for the Blocking rate of Nitrosamine

由圖2可知，黃檸檬提取液質量分數在0～10%范圍內變化時，N-亞硝胺阻斷率隨著質量分數的增加有上升的趨勢，且當質量分數升至10%，N-亞硝胺的阻斷率最高為46.8%。但當質量分數超過10%時，N-亞硝胺的阻斷率隨著質量分數的增加有緩慢下降的趨勢。且菠蘿、木瓜提取液對N-亞硝胺的阻斷率隨著質量分數的增加都呈現出先上升后下降的趨勢，且在質量分數為10%時對N-亞硝胺的阻斷效果最佳，阻斷率分別為48.1%和30.7%，因此根據單因素試驗可以得出，提取液質量分數10%時阻斷N-亞硝胺效果最強。

2.4 亞硝胺阻斷作用最佳復配比的選擇

按正交試驗設計因素水平表2，最佳復配正交試驗結果見表4。

表4 最佳復配比正交試驗設計及結果Table 4 The design and the results of the orthogonal experiment

從9個處理中直觀地找出最優水平組合為4號處理，即A2B1C2，試驗指標值為49.1%，通過正交試驗結果的統計分析，得出最優水平組合為A3B1C2，經進一步試驗檢驗得出，最優水平組合為A3B1C2，即黃檸檬提取液質量分數為12%，菠蘿提取液質量分數為8%，木瓜提取液質量分數為10%，對亞硝胺阻斷效果最好，阻斷率為51.1%，比單因素試驗中最高清除率48.1%（菠蘿）略有提高，天然產物提取液復配得到的混合果汁對亞硝胺有較為理想的阻斷效果。

3 結論

通過清除亞硝酸鹽的最佳復配比正交試驗，得到的最優復配組合為1.0%黃檸檬提取液、1.0%菠蘿提取液、0.8%木瓜提取液混合，清除率為79.5%，天然產物提取液復配得到的果茶汁對亞硝酸鹽具有理想的清除效果；而通過阻斷亞硝胺合成的正交試驗，得到的最優復配組合為12%黃檸檬提取液、8%菠蘿提取液、10%木瓜提取液混合，阻斷率為51.1%，有較好的阻斷亞硝胺合成效果。復配天然產物應用到肉類產品的生產中不僅能起到清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的效果，還能增加產品的營養和風味[29]。這為開發更加安全美味的肉類食品的開發提供了參考。