高效液相色譜法測定蔬菜和水果中15種歐盟優控多環芳烴

王鐘，何漪，王敏，邢燕，殷茂榮

（淄博市疾病預防控制中心，山東淄博255026）

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是非常重要的一類持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs），廣泛存在于自然界中。多環芳烴是由2個或2個以上的苯環以稠環或非稠環的形式相鏈接的性能穩定的化合物，其中大部分化合物具有較強的致癌特性[1]。隨著所含苯環數的增加，多環芳烴的致癌特性明顯增強。目前關于多環芳烴的研究主要集中于美國環保署（U.S Environmental Protection A－gency，EPA）提出的16種優先控制多環芳烴，而對于歐洲食品安全局2008年提出的15種歐盟優控多環芳烴（European priority controlled polycyclic aromatic hydrocarbons，EU-PAHs）的報道較少。歐盟優控多環芳烴中包括8種EPA優控PAHs及其他8種新物質，EU優控新增了更多重質多環芳烴，剔除了EPA優控中的輕質多環芳烴。目前，對于水[3]和土壤[4]中多環芳烴的研究較多，而鮮有對于蔬菜和水果中歐盟優控多環芳烴的研究。截至目前，我國尚未建立檢測蔬菜和水果的歐盟優控多環芳烴檢測的標準方法。由于蔬菜和水果中PAHs的種類復雜且含量較低，故選擇簡單、快速的樣品前處理方法尤為重要。近年來，一些常用的前處理輔助技術[5]例如超聲波、加壓等與傳統前處理方法相結合，開發出了一些高效、經濟的前處理技術。測定多環芳烴含量的方法主要有熒光分光光度法[6]、氣相色譜（gas chromatography-flame ionization detector，GCFID）法[7]、氣相色譜質譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[8]及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-10]等。本研究利用超聲波輔助乙腈提取，經N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和無水 MgSO4凈化，用高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FLD）法檢測蔬菜和水果中15種歐盟優控多環芳烴，取得了較好的結果。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

1.1.1 儀器

Waters e2695液相色譜儀（帶熒光檢測器）、Waters PAH C18色譜柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm）：美國Waters公司；ST 16R型高速離心機：美國Thermo Fisher公司；KQ-250B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；OA-SYS型氮氣吹干儀：美國Organomation；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇實驗儀器廠；Milli-Q型純水機：美國Millipore公司。

1.1.2 色譜條件

色譜柱：WatersPAHC18（5.0μm，4.6mm×250mm）；柱溫：35.0℃；流動相：乙腈＋水，梯度洗脫；柱流速：1.2 mL/min；進樣體積：20.0 μL。液相色譜梯度洗脫程序見表1，液相色譜檢測器條件見表2。

表1 液相色譜儀梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluted program in HPLC

表2 液相色譜檢測器條件Table 2 The conditions of HPLC detector

1.2 試劑與材料

N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）：天津博納艾杰爾科技有限公司；無水MgSO4，純度98%：德國CNW科技公司；15種歐盟優控PAHs混合標準溶液：苯并（c）芴、苯并（a）蒽、屈、5-甲基-1，2-苯并菲、苯并（j）熒蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（a）芘、二苯并（a，l）芘、二苯并（a，h）蒽、苯并（g，h，i）苝、茚并（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，e）芘、二苯并（a，i）芘、二苯并（a，h）芘，濃度均為 10 μg/mL，-18℃下保存：德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）：德國Merck公司。

多環芳烴標準中間液1（100 ng/mL）：德國Dr.Ehrenstorfer公司，-18℃下保存；多環芳烴標準中間液2（20 ng/mL）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司，現用現配。

樣品：按照國家食品安全風險計劃，隨機采集山東省17地市售蔬菜和水果各30份，共計60份。

1.3 試驗步驟

1.3.1 樣品處理

稱取10.0 g粉碎后的蔬菜、水果樣品于50 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈，振搖1 min，超聲30 min，加入5.0 g氯化鈉，振搖1 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液10.0 mL，氮吹濃縮至2.0 mL，加入150 mg PSA和300 mg無水MgSO4，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，吸取上清，過0.22 μm有機濾膜，備用。吸取10 μL，進樣分析。以其標準溶液峰的保留時間進行定性，利用峰面積求出樣品溶液中待測物的濃度。

1.3.2 標準曲線的繪制

分別吸取多環芳烴標準中間液2（濃度為20ng/mL）0.025、0.050、0.25、0.50、1.00 mL，用乙腈定容至 1.0 mL，配制成濃度分別為 0.50、1.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的標準溶液。將配制的系列標準液注入高效液相色譜分離。從低濃度到高濃度依次進樣，以峰面積Y作因變量，分別以15種標準品系列濃度x（ng/mL）作自變量，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品測定

在優化的色譜條件下，吸取標準溶液及樣品測試液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行分離，進樣分析。以其標準溶液峰的保留時間進行定性，利用峰面積求出樣品溶液中待測物的濃度。

1.3.4 結果計算

式中：X為樣品中多環芳烴的含量，μg/kg；A1為樣品峰面積；C為標準溶液濃度，ng/mL；V為樣品定容體積，mL；A2為標準溶液峰面積；m為樣品質量，g。

1.4 試驗條件優化

1.4.1 萃取溶劑的選擇

由于蔬菜和水果的基體成分復雜，且多環芳烴（PAHs）的濃度水平較低，因此選擇適宜的萃取溶劑是保證結果準確可靠的前提。分別選擇正己烷、二氯甲烷和乙腈作為萃取劑，比較其對15種歐盟優控多環芳烴（EU-PAHs）的回收率。

1.4.2 超聲提取時間優化

稱取適量水果蔬菜樣品6份，加入多環芳烴標準溶液，使加標后的樣品中多環芳烴的濃度達5.0 μg/kg，冷凍保存24 h后，考察不同超聲時間對提取效率的影響，試驗考察了在 10、20、30、45、60 min 的超聲提取效果，其回收率與提取時間的趨勢如圖1所示。

圖1 不同超聲提取時間平均回收率趨勢圖Fig.1 Trend chart of average recovery rate for different ultrasound extraction time

由圖1可以看出，超聲30 min～40 min平均回收率變化不大，故超聲時間選為30 min。

1.4.3 分離條件和檢測波長的優化

多環芳烴組分的沸點較高，色譜柱選擇PAH C18（5.0 μm，4.6 mm×250 mm），分離效果良好。分別選取不同配比的水+乙腈作為流動相，從保留時間、分離效果、峰形等進行比較，確定梯度洗脫分析條件。利用紫外檢測器對紫外波長掃描鑒定，利用熒光檢測器掃描確定靈敏熒光波長；最終確定色譜條件，另外，對流動相流速、色譜柱溫度等進行選擇并優化，15種多環芳烴標準的分離效果如圖2所示，該色譜條件下，15種物質均能達到基線分離。

圖2 15種歐盟優控多環芳烴色譜圖Fig.2 Chromatographic charts of 15 EU-PAHs

2 結果與討論

2.1 萃取溶劑的選擇

通過比較，乙腈作為提取溶劑時可獲得較高的回收率，15種PAHs的平均回收率可達90.0%。而正己烷和二氯甲烷做為萃取溶劑時，平均回收率分別為67.2%和81.4%。考慮到本方法以乙腈和水為流動相，在提取過程中選擇乙腈作為提取溶劑，無需溶劑置換，避免了因置換溶劑而造成組分的損失。因此本試驗選擇乙腈做為萃取溶劑。

2.2 方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度

用乙腈為溶劑，配制多環芳烴標準系列，濃度均為0.50 ng/mL～20.0 ng/mL。在試驗條件下分離檢測，每個濃度水平平行測定2次，以標準的峰面積對濃度作曲線，標準曲線相關系數見表3。

分別精密量取混合標準溶液5.00、20.0 ng/mL，加入到已得到濃度的樣品溶液中，使加入后待測物含量分別為1.0 μg/kg和5.0 μg/kg，按上述色譜條件進行分析，每個樣品平行進樣6次測定峰面積，計算回收率和相對標準偏差。在不同的加標濃度下，加標回收率在83.6%～97.2%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）4.2%～12.0%之間。方法的回收率和精密度結果見表3。

表3 方法的回收率、精密度、線性范圍和檢出限Table 3 Recovery，precision，linear range and detection limit of the method

由表3可見，15種多環芳烴在試驗濃度范圍內，線性關系良好，相關系數達0.999以上。方法的最低檢出濃度檢出限（detection limit，LOD）以3倍信噪比計算，檢出限為0.07 μg/kg～0.10 μg/kg。（按取樣10.0 g計算）。

2.3 蔬菜水果中15種歐盟優控多環芳烴濃度水平的檢測

為了解市售水果和蔬菜中15種歐盟優控多環芳烴污染水平。按照全省食品安全風險監測計劃，采集全省17地市市售蔬菜和水果各30份，用本方法分析了蔬菜和水果中15種歐盟優控多環芳烴的濃度水平。通過分析，15種歐盟優控多環芳烴檢出8種，其中屈檢出率最高，共有40份樣品檢出，濃度范圍為0.10 μg/kg～0.81 μg/kg。60份蔬菜水果中15種歐盟優控多環芳烴的檢出情況見圖3。

由圖3可以看出，蔬菜水果中15種歐盟優控多環芳烴以屈、苯并（c）芴、苯并（a）蒽及苯并（g，h，i）苝等 8種多環芳烴檢出率較高，其中屈的檢出率最高，濃度最大達 0.81 μg/kg。

圖3 蔬菜和水果中15種歐盟優控多環芳烴的檢出情況Fig.3 Detection of 15 EU-PAHs in vegetables and fruits

3 結論

本文采用超聲波輔助乙腈提取，PSA和無水MgSO4凈化，高效液相色譜儀分離，熒光檢測器檢測法測定蔬菜和水果15種歐盟優控多環芳烴。該方法操作簡單，試劑消耗量少，且該方法檢測效率高，方法檢測線性范圍寬，準確度、靈敏度高及檢出限低，適用于蔬菜和水果中15種歐盟優控多環芳烴的檢測。