試劑盒聯(lián)合硅膠膜法提取陳舊性骨骼和牙齒DNA

張 科，周小強

骨骼和牙齒是法醫(yī)DNA檢驗中常見的生物檢材，其DNA檢驗結果對于身源查找可能是唯一的識別依據(jù)。骨組織內的細胞由于被鈣化的細胞外基質所保護，即使面對各種外界環(huán)境也可以得到長期有效的保存，這是檢驗的基礎，但這也大大增加了提取難度。在這類檢材的提取方法研究中，先后出現(xiàn)了CTAB法[1]、硅珠法[2]、壓力循環(huán)儀法[3]等，但這些方法需要EDTA長時間脫鈣或純化，操作步驟相對繁瑣，提取難度較大，同時也因操作環(huán)節(jié)繁瑣，提高了樣品污染的概率。如何從中獲得高質量的DNA模板和滿意的STR分型，是法醫(yī)物證檢驗鑒定工作必須正視的挑戰(zhàn)。利用PrepFiler Express BTATM試劑盒結合Automate ExpressTM自動化法醫(yī)提取系統(tǒng)對骨骼牙齒的提取已有報道[4]，其裂解能力、提取效率、獲得模板的質和量較其他提取方法有較大的優(yōu)勢。本研究通過PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法建立陳舊性骨骼牙齒DNA檢材的提取方法，旨在實際工作中充分拓展該試劑盒的應用。現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源選取骨骼10份(依次編為1～10號)，牙齒10份(依次編為11～20號)，均來自于日常檢案收集的不同個體樣本。上述樣本經(jīng)骨骼孵育液聯(lián)合硅珠法或利用PrepFiler Express BTATM試劑盒結合Automate ExpressTM自動化法醫(yī)提取系統(tǒng)均獲得良好分型，以為對照。

1.2 主要儀器與試劑電鉆、砸牙器(公安部物證鑒定中心)；24孔1.5 mL恒溫混勻儀(Eppendorf公司，德國)；QIAcube全自動化核酸純化儀(QIAGEN公司，德國)；9700型PCR擴增儀，3500XL型基因分析儀(Life Technologies公司，美國)；PrepFiler Express BTATM試劑盒(采用其中的裂解液、蛋白酶K，LysepTM柱及裂解管)，QIAamp DNA Investigator kit(QIAGEN公司，德國)，GolbalFiler試劑盒(Life Technologies公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理刮去待檢骨骼樣本表層垢物并清水洗凈表面，再用無水乙醇沖洗并拭干，做好標記，紫外燈下各面均照射15 min以上。低轉速鉆取選定部位，收集100 mg左右的骨粉置于PrepFiler裂解管內。選擇牙根、牙冠完整無損的牙齒，刮去表層并清水洗凈表面，放入干凈的小燒杯內，加入5%的次氯酸鈉溶液浸泡約15 min后取出，用水沖洗1 min，再用無水乙醇沖洗并拭干，做好標記，紫外燈下照射15 min以上。砸斷牙齒根部，砸成粉末，收集100 mg左右的牙粉置于PrepFiler裂解管內。

1.3.2 DNA的提取將20個實驗樣本分別加入PrepFile裂解液300 μL、PK10 μL(1 mol·L-1)、DTT10 μL(10 mg·mL-1)，振蕩混勻后放置在24孔1.5 mL恒溫混勻儀上1 200 r·min-1消化2 h，快速離心，盡量多地吸取其上清至1.5 mL收集管上的LysepTM柱內，12 000 g離心1 min，棄掉濾柱。至此步驟，將上述實驗樣本按照QIAcube全自動化核酸純化儀操作手冊提取檢材DNA，模板DNA終體積為60 μL備檢。

1.3.3 DNA的擴增及電泳檢測將上述20個實驗樣本采用GolbalFiler試劑盒進行擴增，擴增體系10 μL，其中Mix 3 μL，Primer 1 μL，模板DNA均為6 μL，擴增循環(huán)次數(shù)增加至30 cycles(循環(huán)參數(shù)視后期檢驗情況進行調整，其他擴增參數(shù)同試劑盒說明書)。上述擴增產物均以3500XL型基因分析儀進行電泳分離和激光掃描分析，使用GeneMapper?ID-X軟件進行數(shù)據(jù)分析，獲得各樣本STR基因分型。

2 結果

對20個研究樣本的DNA檢驗結果進行初步分析(RFU≥100，F(xiàn)ilter：10%)，以基因座上分型相同為檢出標準，排除因可能的DNA濃度過低所致優(yōu)勢擴增和無效擴增結果。統(tǒng)計得出實驗樣本檢出基因座數(shù)量，見表1。從檢驗結果來看，通過PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法[5]對陳舊性骨骼牙齒DNA檢材獲得了相對滿意的效果，利用GolbalFiler試劑盒檢出13個完整基因分型的占80%。從分析圖譜來看，未能檢出的基因座往往集中于D16S539、D2S1338、D18S51等較大片段。同對照樣本相比，30個擴增循環(huán)數(shù)的條件下，經(jīng)該方法檢驗獲得的峰值普遍較低。

表1 文中提取方法檢出基因座數(shù)量情況

3 討論

PrepFiler Express BTATM試劑盒往往同Automate ExpressTM自動化法醫(yī)提取系統(tǒng)協(xié)同使用，同其他方法相比有著多方面顯著的優(yōu)勢[6]，其中BTA試劑盒的裂解能力、裂解效率和其中提供的特殊構造的納米級磁珠是其亮點。本研究中的實驗更傾向于利用BTA試劑盒的裂解能力和裂解效率以獲得較多的DNA，且前期消化裂解的過程減少了很多繁復的步驟，消除了因脫鈣可能造成的DNA損失[7]，然后通過QIAcube核酸提取儀對裂解獲得的DNA進行純化[8]和濃縮[9]。本研究實驗獲得了較為滿意的結果，由此表明通過實驗試圖建立的方法可以為陳舊性骨骼牙齒類檢材的提取提供思路，對于沒有購置Automate ExpressTM自動化法醫(yī)提取系統(tǒng)的實驗室，可利用該方法手工或開展陳舊性骨骼牙齒類檢材的檢驗工作。

從20份實驗樣本的結果分析來看，經(jīng)該方法檢驗獲得的峰值普遍較低，3份骨骼樣本和1份牙齒樣本未得到滿意的基因分型結果，提示此方法實驗流程還需進一步優(yōu)化，以獲取更高質量、更多數(shù)量的DNA。考慮產生這一問題的原因可能有：①兩種試劑盒所包含的試劑之間有不兼容的情況存在，影響了提取效率；②未檢出的骨骼牙齒樣本本身條件極差，其中就有2份骨骼長期暴露于潮濕環(huán)境中，骨松質及髓腔已高度腐敗，2份牙齒牙根處裂開，牙髓腔內變色。③擴增參數(shù)、擴增體系、適度增加Taq酶、增加引物、PCR后純化等方式進行調整以提高檢出率還沒有進一步的研究和實驗。實驗過程提示：始終不能忽視骨骼牙齒類檢材檢驗的復雜性，由于該類檢材提取的DNA濃度較低，經(jīng)常會發(fā)生丟峰或非特異性擴增情況出現(xiàn)。如果沒有對照樣本，仍建議通過多點取樣、平行試驗、互為對照的方式，以保證檢驗結果的準確性。

作者試圖建立通過PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法提取人體陳舊性骨骼牙齒DNA的研究還存在一定的局限性，對陳舊和腐敗樣本的研究還需大量實踐總結；未對該方法和其他常用方法提取的DNA進行定量研究和對照；操作步驟和細節(jié)還未進行精細化固定。但就實驗結果來看，該方法的提取效率能夠滿足DNA實驗室的常規(guī)需求，并作為其他方法的有效補充。