全腦缺血再灌注誘導大鼠海馬CA1區Trx巰基去亞硝基化機制的研究

楊紅寧，呂蘭欣，顏曉慶，韓 東，胡書群，許 鐵

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種脂溶性、可擴散的、小分子氣體信號分子，同時也是一種弱自由基，在調節生理和病理生理活動中起重要作用[1-3]。早期研究表明NO對細胞內生物活動的調節主要通過NO/cGMP途徑，即NO誘導cGMP的產生，進而調節蛋白激酶G的活性，影響生物體的活動[4-5]。近來文獻表明NO通過蛋白質巰基亞硝基化/去亞硝基化的機制來發揮作用，蛋白質巰基亞硝基化/去亞硝基化作為一種可逆性蛋白質翻譯后修飾、調節不同的信號轉導通路，進而影響許多細胞的功能[1,6]。

腦缺血再灌注損傷的發病機制假說包括鈣超載、谷氨酸興奮毒性及氧自由基學說。谷氨酸受體分為代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)和離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)。iGluRs根據其所首選的配體不同可分為NMDA受體、AMPA受體和KA受體[7-8]。腦缺血再灌注損傷中，神經細胞內的nNOS活性增強，產生大量的NO，能夠對神經細胞產生損傷作用[9-11]。

Trx(thioredoxin)在正常生理狀態下其本身是亞硝基化的，全腦缺血再灌注后Trx巰基發生去亞硝基化[12-14]。本研究主要采用大鼠全腦缺血再灌注不同的時間來探討全腦缺血再灌注誘導Trx巰基去亞硝基化的最佳復灌時間，以及外源性NO供體GSNO(S-nitrosoglutathione)和SNP(sodium nitroprusside)在全腦缺血再灌注后Trx的去亞硝基化機制中的作用，并用焦油紫染色進一步驗證外源性NO供體GSNO和SNP是否能對全腦缺血再灌注導致的神經元損傷有保護作用。現報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材試劑：GSNO購自Sigma公司，SNP購自徐州市中心醫院，Trx抗體購自Santa Cruz公司，其他試劑為國產分析純。器材：電動勻漿器購自美國Glas-Col公司，全波長酶標儀購自美國Molecular Device公司，蛋白電泳及電轉移裝置購自美國Bio-Rad公司，圖像處理儀購自美國Gene公司，大鼠腦立體定位儀購自美國STOLTING公司。

1.2 實驗動物購自徐州醫科大學實驗動物中心的雄性成年無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD大鼠，體質量250～300 g，隨機分為假手術組(Sham組)、全腦缺血再灌注組(I/R組)、腹腔注射組(SNP組)、側腦室注射(GSNO組)及溶劑對照組(生理鹽水組腹腔注射/側腦室注射)，每組各6只。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型及樣品制備采用四動脈結扎法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，以20%水合氯醛(300～350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈，電凝椎動脈。手術第2天動物于清醒狀態下結扎雙側頸總動脈，全腦缺血15 min。假手術組只進行顱部手術的皮膚切口，然后縫合。GSNO組(每千克體質量動物0.1 mg，藥物溶于生理鹽水，于缺血前20 min側腦室注射)，SNP組(SNP溶解于生理鹽水中，以5 mg·kg-1的劑量分別于缺血前30 min、缺血后40 min和130 min腹腔注射給藥，即每兩次給藥之間相隔90 min)。溶劑對照組注射等量溶劑生理鹽水。全腦缺血復灌注后，斷頭取腦，分離雙側海馬CA1區，加勻漿緩沖液后勻漿離心取上清液，用BCA微量法測定蛋白濃度。

1.3.2 蛋白巰基亞硝基化測定用生物素轉化法(Biotin-Swich method)[11]測定蛋白亞硝基化：用HEN液(250 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH 7.7，1 mmol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1neocuproine)勻漿，1 000 g 4 ℃離心10 min，取上清；測蛋白，計算蛋白濃度，轉變為統一濃度0.8 mg·mL-1，每次取0.8 mg分裝蛋白，用HEN液補充至1 mL；向分裝的蛋白中加10% CHAPS至終濃度為0.4%，再加4倍體積Blocking buffer，置于50 ℃ 20 min，不斷搖勻；加2倍體積丙酮放入-20 ℃，20 min到30 min后2 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清；加HENS液(250 mmol·L-1HEPES，pH 7.7，1 mmol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1neocuproine，1% SDS) 0.1 mL·mg-1重懸，轉入EP管中，加Biotin-HPTP(4 mmol·L-1)，即labeling solution，體積為重懸液的1/3，再加Ascorbate solution，體積為重懸液的1/5，25℃水浴1 h；加2倍體積的冰丙酮放入-20 ℃ 20 min，2 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清；加HENS液，0.1 mL·mg-1，重懸，加2倍體積的中和液(20 mM HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.5% TritonX-100)，再加15 μl·mg-1Steptavidin-Agarose，冷庫旋轉混勻1 h；每管加0.5～0.6 mL(600 mM NaCl)中和液洗5次，800 g×1 min，4 ℃離心；用洗脫液(20 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA和100 mmol·L-12-巰基乙醇)加4×sample buffer，混勻煮沸5 min，冷卻待用。

1.3.3 免疫印跡等量蛋白樣品經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉法電轉移至NC膜上。轉移后的NC膜經3% BSA封閉后加入不同的稀釋好的一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入相應的二抗(羊抗兔IgG-AP 或羊抗鼠IgG-AP或驢抗羊IgG-AP)，37 ℃反應2 h。洗膜。曝光法顯色，結果以圖像處理儀(Gene Company)分析處理，并以LabWorks軟件分析處理，各條帶的吸光值(O.D值)以同一張膜上假手術組的倍數表示。

1.3.4 焦油紫染色大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，4%的多聚甲醛快速灌注后，大鼠斷頭取腦。4%多聚甲醛固定，常規包埋與切片。按焦油紫染色說明書染色，中性樹脂封片。在高倍鏡下觀察海馬CA1區神經元，有清楚的細胞核，胞體著色良好的計為成活神經元，成活神經元密度以1 mm長度內成活錐體神經元的數量表示。

2 結果

2.1 復灌6 h Trx巰基去亞硝基化程度最高全腦缺血后復灌注不同時間組相比，Trx巰基亞硝基化水平在復灌6 h時最低(P<0.05)，見圖1。證明大鼠全腦缺血再灌注誘導Trx去亞硝基化的最佳復灌時間為6 h。

①與其他組相比差異有統計學意義(P<0.05)。圖1 Trx去亞硝基化水平電泳圖

2.2 GSNO、SNP抑制Trx巰基去亞硝基化與I/R組相比GSNO組和SNP組Trx的亞硝基化水平明顯增高(P<0.05)，見圖2A、B。證明外源性NO供體能夠抑制全腦缺血再灌注導致的Trx去亞硝基化。

2.3 GSNO和SNP組海馬神經元遲發性死亡情況用焦油紫染色來檢測腦缺血再灌注刺激后錐體細胞的存活情況。在Sham組，正常的錐體細胞顯示出圓形淡著色的細胞核(圖3 a, f)，而在I/R組，死細胞呈現出固縮的細胞核，呈皺縮濃密的不規則狀(圖3 b, g)。與I/R組相比，GSNO組(圖3 c, h)，SNP組(圖3 d, i)神經元錐體細胞的死亡明顯減少，差異有統計學意義，而溶劑對照組(圖3 e, j)則與I/R組相比無統計學意義，見圖4。說明GSNO，SNP能夠減少CA1區神經元損傷，對神經元有保護作用。

①與I/R組相比差異有統計學意義(P<0.05)。A:GSNO組；B:SNP組圖2 Trx去亞硝基化水平電泳圖

3 討論

蛋白質巰基亞硝基化和去亞硝基化，是蛋白質功能動態調控中的一種重要翻譯后修飾，在調節生理和病理情況下的蛋白酶活性中起著重要的作用，能夠調節不同的信號轉導通路進而影響許多細胞的功能[6]。蛋白質半胱氨酸巰基被NO修飾發生亞硝基化，是信號轉導中一種常見的機制[15-17]。蛋白質的亞硝基化/去亞硝基化可以影響到蛋白的活性、穩定性。酶原的降解、酶的活性位點的暴露、功能蛋白活性位點的修飾都可以與亞硝基化修飾有關[18-20]。Trx是一種重要的具有蛋白還原酶活性的抗氧化蛋白，五半胱氨酸殘基在32、35、62、69、73位，是一種抗凋亡蛋白，因為它能夠抑制凋亡體前蛋白[8]。Trx的氧化還原調控和抗凋亡功能依賴69位半胱氨酸的S-亞硝基化。Trx在正常的生理狀態下是亞硝基化的，Trx能夠清除活性氧和維持其自身的氧化還原調控功能，有助于抗凋亡，而全腦缺血再灌注誘導Trx發生去亞硝基化對神經元造成了損傷[21]。本研究采用大鼠四動脈結扎法造模，從本研究中可以看出，全腦缺血再灌注后Trx發生巰基去亞硝基化，并且在復灌6 h時Trx的去亞硝基化程度最高。

圖3 各組缺血再灌注后錐體細胞存活情況

①與I/R組相比差異有統計學意義(P<0.05)。圖4 各組缺血再灌注后細胞存活情況比較

越來越多的數據表明，NO能夠調節蛋白質巰基的亞硝基化修飾，即在電子受體的存在下可以與蛋白質巰基發生反應，形成巰基—亞硝基化蛋白(SNO蛋白)。因此，本研究中給予了NO供體GSNO和SNP，來研究外源性NO供體是否能夠抑制全腦缺血誘導的Trx去亞硝基化，對細胞有保護作用。本研究結果顯示，全腦缺血再灌注后Trx發生明顯的去亞硝基化，而外源性NO供體GSNO和SNP能夠減弱這種變化，通過焦油紫染色進一步證實外源性NO供體能夠抑制Trx去亞硝基化，對腦缺血損傷的神經元具有保護作用。

本研究初步揭示了Trx去亞硝基化影響神經元損傷的機制，為后續研究Trx去亞硝基化對神經元損傷的下游神經通路提供了基礎，也為研究卒中疾病的作用機制提供了新的理論基礎。