羅非魚細菌性敗血癥的防控途徑探索

肖俊軍

摘 要 嗜水氣單胞菌是一種人體和動物體內廣泛存在的致病菌類型，細菌感染后會誘發腹瀉、敗血癥等問題，造成巨大的經濟損失。羅非魚細菌性敗血癥是一種嗜水氣單胞菌感染所致的常見魚體疾病，會導致病魚大量死亡，給養殖戶帶來巨大影響。因此，將從羅非魚細菌性敗血癥的發生原因、診斷以及細菌培養情況等方面出發，對其綜合防控措施進行論述分析。

關鍵詞 羅非魚;細菌性敗血癥;嗜水氣單胞菌

中圖分類號：S943 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.12.074

細菌性敗血癥是一種羅非魚細菌感染常見疾病，也是導致魚類大量死亡的主要原因，主要致病菌類型為嗜水氣單胞菌。該種類型細菌具有較高的溶血性，且會出現細胞毒性、腸毒素和外毒素。疾病常見特征為羅非魚肛門紅腫、鰭基出血及體表出血等。羅非魚細菌性敗血癥具有死亡率高、發病突然等特征，是為害魚類健康最嚴重、經濟損失最大、流行時間最長、流行范圍最廣、影響面積最大以及種類最多的傳染病類型。

1 疾病發生的原因

1.1 魚體抗病力差

天氣變化、高溫季節等自然環境的改變，投喂霉變飼料、營養供給不良，頻繁施藥或是過量用藥，養殖水體的大量換水與加水，以上原因都會降低羅非魚的抗病能力，強化應激反應。一旦水中出現致病菌，則會最終誘發羅非魚細菌性敗血癥問題[1]。

1.2 水質惡化

池塘養殖過程中會因為施肥或是投餌過量而降低養殖水體的營養成分含量。高溫季節養殖過程中，如果大量施肥或是投放魚餌，則會降低水體的溶氧能力，增加亞硝酸鹽、氨氮等有害物質，影響水體的正常循環，最終誘發細菌感染。

1.3 發病季節

每年的3—11月是羅非魚細菌性敗血癥發生率較高的季節，其中5—9月為發病高峰期，10月后疫情會有所改善，發病率最高的水溫為25～32 ℃[2]。

2 疾病診斷

2.1 初步診斷

羅非魚細菌性敗血癥的主要特征表現為魚群大量聚集在池塘出水口緩緩游動、食欲不振、魚體色發黑等。其中，眼眶、背部、鰓蓋、腹鰭和胸鰭等部位均會出現上述癥狀。魚體發病后，可見肛門紅腫和體表粘液增多等特征。鏡檢證實病魚體表黏液、鰓等患病部位無寄生蟲，魚體解剖可見腹腔內出現大量腹水，鰓蓋內緣出血，且腸腔、腸道內無食物。病魚肝臟可見暗紅色或是土黃色，部分病魚腹部或是肝臟部位可見病灶出血癥狀。養殖水體理化指標檢測結果證實：pH值為7.4、亞硝酸鹽偏高、氨氮偏高、水溫26.8 ℃[3]。

2.2 實驗室分離、純化與鑒定

使用70%濃度的酒精消毒病魚胸腹部，隨后使用無菌蒸餾水進行3次洗滌;由肛門處打開一個切口，從腹部左側和右側分別向上剪去胸腹壁，保證魚體內的臟器充分暴露;再使用70%濃度的酒精消毒魚體臟器，使用無菌水進行徹底沖洗;通過灼燒后冷卻的接種環，由肝、脾和腎等部位分別蘸取組織，再分別接種至普通營養瓊脂培養基上;將培養基置于生化培養箱內，以30 ℃的溫度進行24 h培養。結果證實，魚體肝、脾、腎等部位均出現菌落，且菌落特征表現為淡黃色或無色的圓整、光滑以及微凸形態，且伴有芳香的氣味。使用濕潤、圓形以及中等大小的單個菌落，分別進行2～3次分離培養。純化處理后的菌株置于30%的甘油中，并在-70 ℃冰箱中保存，待后續鑒定。菌落大小因培養時間溫度而異，直徑過大的菌落不會產生色素[4]。

通過梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統實施病原菌鑒定。結果證實，嗜水氣單胞菌是最主要的病原菌類型，其pH值為6～11，7.27為最適宜的pH值環境。嗜水氣單胞菌適應的水溫范圍在14～40 ℃，最適宜的溫度是28～30 ℃，因而夏秋季節的嗜水氣單胞菌繁殖率最高，通常每15～20 min為一個繁殖周期。嗜水氣單胞菌屬于一種條件致病菌，通常可在養殖環境中廣泛分布。若魚體的養殖環境理化條件改變或是生理狀態改變，則會誘發嗜水氣單胞菌感染類疾病。嗜水氣單胞菌能夠產生較強的外毒素作用，進入魚體后會在腸道內增殖，并由門動脈進入腎臟、肝臟等組織，最終誘發血液系統疾病或是肝臟、腎臟等器官疾病[5]。

3 細菌培養

通過平板稀釋培養法進行嗜水氣單胞菌篩選培養，選擇適當顏色、透明度、光澤、表面結構、邊緣形狀、形狀和大小的微生物菌落，挑選后編號。將所選菌落置于PDA培養基上，并在28 ℃條件下培養4天。以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，通過抑菌圈法進行嗜水氣單胞菌抑菌菌株的培養和保存。從拮抗菌株的培養特征來看，它具有最強的拮抗性，在蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯以及葡萄糖酵母膏培養基中接種，并保存在28 ℃環境下進行3～7 d培養。從結構可知在不同培養基上的生長形態、基內菌絲、氣生菌絲及色素。使用纖維素水解、明膠液化、碳源利用、淀粉水解和H2S產生等試驗進行生理生化特征的鑒定。將菌株LFJK-11接種在LB培養基中，連續連續12～18 h的震蕩培養，提取基因組DNA，并以DNA組為模板，對16SrDNA基因擴增通用引物進行PCR擴增處理，結構可見16SrDNA。其中，引物序列為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，用DNA膠回收試劑盒純化，然后直接寄至上海生工測序部進行測序。將測序結果在NCBI上進行比對分析，篩選出9株菌株16SrDNA的全序列，使用ClustalW軟件構建系統進化樹。

拮抗檢測篩選可見1株對嗜水氣單胞菌HCLF-2具有一定拮抗作用的菌株，編號為LFJK-11，抑菌圈直徑為15.6 mm[6]。如表1所示，LFJK-11菌株的拮抗作用對于大腸桿菌、黑霉菌、金黃色葡萄球菌以及蘇云金桿菌的效果均較為理想，且其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，而對黑霉菌的抑制作用相對較差。發酵液稀釋30～60倍，它的拮抗作用仍然較為顯著，說明該菌株的發酵性能良好[7]。通過劃線法分別在菌株上接種蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯和葡萄糖酵母膏，并在28 ℃環境下連續培養7天。結果證實，葡萄糖酵母膏培養基上的菌株生長最好，生長速度較快，菌落較大，邊緣呈放線狀向外擴散，表面干燥有突起，孢子呈圓形，具有土腥味。

4 防控措施

4.1 預防措施

1）徹底清洗和消毒魚塘。將魚塘內的淤泥徹底清除，是預防羅非魚細菌性敗血癥的最有效措施。具體地，可在冬季徹底清理魚塘后，噴灑漂白粉或是生石灰進行消毒，調節水體環境。2）水體消毒。在魚塘內噴灑生石灰，劑量為20～30 g·m-3，以改善水質環境，調節水體的含氨氮量[8]。3）內服預防。高溫季節在每100 kg飼料中加入30 g維生素E和50 g穩定性維生素C，以增強羅非魚的抗病能力。4）日常飼養。養殖戶應掌握科學養殖的措施，避免投喂變質的飼料，保證魚體自身的抗病能力。5）注射疫苗。魚種養殖前可浸泡或注射嗜水氣單胞菌疫苗，并保證用法正確[9]。

4.2 治療措施

1）全面噴灑6.6%以上的二氧化氯，劑量為0.20～0.29 g·m-3。若病情較為嚴重，可每2天使用1次，也可連續3～5 d投喂0.10～0.15 g·kg-1魚的氟苯尼考粉，若病情嚴重可延長用藥周期。2）全面潑灑50～100 mg·m-3的苯扎溴銨，連續使用2次，也可內服0.1 g·kg-1魚的磺胺藥[10]。

5 結語

導致羅非魚發生細菌性敗血癥的原因包括環境因素、季節因素以及魚體自身因素等，因而需要從魚苗選擇、環境改善和細菌監測方面著手進行綜合防治，采取全面的防控措施，降低細羅非魚菌性敗血癥的發生率。

參考文獻：

[1] 李夢茜，張振旺.羅非魚細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌拮抗菌株的篩選和鑒定[J].江蘇農業科學，2017，45（3）：129-130.

[2] 韓殿峰，鄒榮婕，宋譯，等.丁香酚在羅非魚血漿中藥代動力學研究[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（8）：2190-2191.

[3] 沈濤，沈藝敏，李仁煥.飼料脂肪水平對紅羅非魚稚魚生長及血液生化指標的影響[J].飼料研究，2019，5（9）：15-16.

[4] 張聰，朱照華.裹漿的組成與黏度對裹面包屑羅非魚片品質影響的研究[J].中國食品添加劑，2019，7（5）：55-56.

[5] 雷燕，肖洋，趙振鋒，等.羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應用[J].廣東海洋大學學報，2019，39（3）：1-2.

[6] 韋陽道，楊軍，文衍紅，等.羅非魚豎鱗病病原維氏氣單胞菌的分離鑒定與致病性研究[J].中國畜牧獸醫，2016，43（11）：3047-3052.

[7] 李聰，蔡巖，周永燦，等.海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J].水產科學，2015，34（10）：640-646.

[8] 陳善真，潘忠超，段元慧，等.一株尼羅羅非魚致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].廣東農業科學，2014（7）：158-161.

[9] 張棟，龐紀彩，高風英，等.3個不同尼羅羅非魚（Oreochr-omis niloticus）群體MHC IIA基因多態性和遺傳分化[J].基因組學與應用生物學，2019，38（4）：1532-1533.

[10] 林雪，段靜娜，趙玉蓉，等.不同組成酸化劑對羅非魚生長性能和抗氧化及肝臟代謝酶活性的影響[J].飼料工業，2019，40（8）：51-52.

（責任編輯：趙中正）