發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪脂肪氧化的影響

馬歡，梁琪*，宋雪梅，張炎

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省功能乳品工程實驗室(甘肅農業大學)，甘肅 蘭州，730070)

牦牛是生活在青藏高原和鄰近高地的一種稀有物種，可為當地牧民提供優質的肉、乳等生活原料[1-2]。與普通牛乳相比，牦牛乳的蛋白質、乳糖、脂肪和礦物質營養含量更高[3]。干酪是世界上被廣泛消費的發酵乳制品，具有很高的營養價值[4]，聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)和世界衛生組織(World Health Organization, WHO)將干酪定義為：以牛乳、奶油、部分脫脂乳、酪乳或這些產品的混合物為原料，經凝乳并分離乳清而制得的新鮮或發酵成熟的乳制品[5]。牦牛乳硬質干酪營養豐富，脂肪和蛋白質含量相當于新鮮乳的10倍左右，每100 g干酪含鈣720 mg，是牛乳的14倍，且鈣磷比適中，是補鈣的最佳食品[6-7]。

干酪中的發酵劑是指在干酪生產和成熟期間，可促進干酪發酵與成熟的特定微生物培養物。干酪生產中所用的發酵劑可分為霉菌發酵劑和細菌發酵劑2類，但霉菌發酵劑的應用范圍沒有細菌發酵劑廣泛。細菌發酵劑以乳酸菌為主，包括乳酸乳球菌乳脂亞種和乳酸亞種、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等。乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactissubs.Cremoris)和乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubs.Lactis)這2個亞種在乳制品中作為嗜溫發酵劑被廣泛使用[8]。

干酪中的脂肪不僅具有營養價值，而且在干酪的質地、風味和香氣的發展中發揮重要作用，賦予其感官和功能特征[9]。脂肪的氧化降解是指甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯在脂酶作用下代謝產生游離脂肪酸和風味前體物質的過程[10]，是干酪成熟過程中必經的一個動態而又復雜的生物化學變化[11]。

發酵劑的種類及添加量，在干酪加工過程中有著重要的作用[12]。研究表明，發酵劑可在干酪中大量殘留，并在干酪成熟期間釋放大量的脂酶，使脂肪氧化降解，從而形成干酪特有的風味[13]。目前，國外關于山羊干酪[14]、再制干酪[15]、菲達干酪[16]和不同乳脂含量山羊干酪[17]中脂肪氧化的研究報道較多，但關于發酵劑添加量對牦牛乳硬質干酪成熟期間脂肪氧化影響的研究還未見報道。因此，本試驗通過對牦牛乳硬質干酪的理化指標和氧化指標進行研究，分析發酵劑添加量和成熟時間與干酪理化性質和脂肪氧化情況的關系，以期找到干酪中脂肪氧化的動態變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳，采自甘肅天祝縣抓喜秀龍鄉；嗜溫發酵劑、凝乳酶、無水Na2SO4、無水乙醚、NaCl、CaCl2、NaOH、Na2S2O3、2, 4-二硝基苯肼、硫代巴比妥酸、異辛烷、三氯甲烷、甲醇、KI、三氯乙酸、乙醇、苯、冰乙酸、三氟化硼甲醇絡合物,所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

干酪槽，自制；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PHS-3C 精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；AL204 分析天平，梅特勒-托利多上海儀器有限公司；BCD-539WF電冰箱，青島海爾股份有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS26-電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；真空包裝機，溫州市大江真空包裝機械有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳硬質干酪加工工藝流程

原料乳→檢驗→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(35 ℃)→添加發酵劑(1%、2%、3%)→添加CaCl2(0.3 g/L)→添加凝乳酶(0.67%)→凝乳→切割、排乳清→二次加熱(45 ℃)→排乳清→攪拌、加鹽(凝塊的2%)→堆釀(2 h)→壓榨成型→真空包裝→成熟

1.3.2 牦牛乳硬質干酪出品率測定[18]

將牦牛乳硬質干酪壓榨完后稱其質量，根據干酪水分含量與干酪質量計算干酪出品率(公式1)：

(1)

為了更加準確地比較3種牦牛乳硬質干酪的出品率，將干酪的實測出品率校正到水分含量為45%時再進行計算，如公式2。

校正出品率/%=

(2)

1.3.3 牦牛乳硬質干酪中水分含量的測定

參考GB 5009.3—2016中的直接干燥法進行。

1.3.4 干酪中NaCl含量測定[19]

將準確稱取的2 g干酪樣品置于250 mL錐形瓶內，加入10 mL蒸餾水和0.05 mol/L的AgNO3溶液25 mL，在80 ℃的水浴中加熱至試樣溶解后加入10 mL濃H2SO4，攪拌7～10 min，待溶液澄清后，過濾，除去脂肪，向濾液中加入2 mL硫酸亞鐵銨指示劑和10 mL蒸餾水，用0.05 mol/L的硫氰酸鉀溶液滴定至橘紅色，15 s內不變色即可。同時，進行空白試驗，計算NaCl的含量。結果計算如公式(3)：

(3)

式中：m,干酪樣品質量,g；V,消耗硫氰酸鉀的體積,mL；V0,空白消耗硫氰酸鉀的體積,mL；c,硫氰酸鉀的摩爾濃度,mol/L；0.002 92,1 mL 0.05 mol/L硫氰酸鉀溶液相當的NaCl的質量。

1.3.5 干酪中pH值的測定[20]

稱取2 g干酪樣品，將干酪和蒸餾水以1∶10的比例混合，研磨勻漿后，用pH計測定漿液pH值。

1.3.6 干酪成熟過程中干酪中酸度值(acidity value, ADV)值的測定[21]

稱取5～10 g干酪樣品置于燒杯中，加入50 mL石油醚與乙醇混合液(2∶1)勻漿，過濾，取濾液，加入少許酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液進行滴定，出現玫紅色，15 s內不變色即可。結果計算如公式(4)：

(4)

式中：V,滴定所用體積,mL；c,氫氧化鉀乙醇溶液的摩爾濃度,mol/L；m,干酪樣品的質量,g。

1.3.7 干酪中過氧化值(peroxide value, POV)值的測定

參考GB 5009.227—2016中過氧化值的測定方法，稱取2～5 g干酪樣品置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL乙酸-異辛烷溶液，勻漿混勻試樣。加入0.5 mL飽和KI溶液，蓋上蓋子搖動1 min±1 s，然后放置暗處3 min左右，取出加入30 mL蒸餾水后立即加入0.5 mL淀粉溶液，滴定至藍色消失，即為終點。同時進行空白試驗。用過氧化物的毫克當量數表示時，結果計算如公(5)：

(5)

式中：V,試樣滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；V0,空白滴定消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL；c,硫代硫酸鈉標準滴定溶液的濃度,mol/L；m,試樣質量,g；1 000,換算系數。

1.3.8 干酪中羰基價(carbonyl value, CV)的測定

參考GB 5009.230—2016中羰基價(CV)的測定方法，稱取0.025～0.5 g試樣，置于25 mL具塞試管中，加5 mL苯溶解油樣，加3 mL三氯乙酸溶液及5 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，仔細振搖混勻。在60 ℃水浴中加熱30 min，反應后取出用流水冷卻至室溫，沿試管壁緩慢加入10 mL KOH-乙醇溶液，使成為二液層，旋渦振蕩混勻后，放置10 min。以1 cm比色杯，用試劑空白調節零點，于波長440 nm處測吸光度。按公式(6)計算：

(6)

式中：X,試樣的羰基價(以油脂計),meq/kg；A,測定時樣液吸光度；854,各種醛的毫克當量吸光系數的平均值；m,油樣質量，g；1 000,換算系數。

1.3.9 干酪中硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value, TBA)的測定

參考ARYEE等[22]和SALIH等[23]的方法并略加修改。稱取10 g試樣，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸混合液，振蕩30 min，雙層濾紙過濾2次。取5 mL上清液加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液，沸水浴中保溫40 min，取出冷卻1 h后，以16 000 r/min離心5 min，取8 mL上清液加5 mL氯仿搖勻，靜置分層后取上清液，分別在532 nm和600 nm處比色，記錄吸光度并計算硫代巴比妥酸值。按公式(7)計算：

TBA(mg/100g)=(A532-A600)×72.06×10/155

(7)

式中：三氯乙酸混合液;7.5 g三氯乙酸,0.1 g EDTA定容至100 mL；0.02 mol/L TBA溶液，0.288 3 g TBA定容至100 mL。

1.4 數據統計與處理

試驗每個處理重復3次，采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析和Pearson相關性分析，Origin 7.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳硬質干酪常規理化指標

2.1.1 發酵劑添加量對牦牛乳硬質干酪出品率的影響

通過干酪出品率可以了解干酪的生產效能并反映工藝參數是否經濟合理[24]。由表1可知，發酵劑添加量對實測出品率和校正出品率均有極顯著的影響(P<0.01)，發酵劑質量分數為1%、2%和3%時，干酪的校正出品率分別為18.9%、19.4%和18.6%。牦牛乳硬質干酪的出品率隨發酵劑添加量的增加呈現出先增大后降低的趨勢，當發酵劑質量分數為2%時，干酪實測出品率最高，達19.4%，這是由于發酵劑質量分數為1%時，產酸較慢，乳清排出率低，造成干酪出品率下降；發酵劑質量分數為3%時，產酸速度快，產酸量增大，部分蛋白質被分解成小分子肽類物質溶于乳清，造成了干酪的損失。

表1 發酵劑添加量對干酪出品率的影響

注：不同字母表示發酵劑添加量對其差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪pH值的影響

已有研究表明，隨著NaCl含量的升高，干酪的pH值會隨之改變[25]。pH值過低，會導致干酪過硬、過脆，pH值過高，會導致干酪過軟、失形[26]。由圖1可知，發酵劑質量分數為1%～3%的3種牦牛乳硬質干酪的起始pH值之間差異顯著(P<0.05)，但其在成熟90 d的過程中變化趨勢相同，均呈現先降低后增加的趨勢，成熟時間為30 d時pH值最小，分別為5.59、5.47和5.38，這是因為成熟前期，干酪中的乳糖轉化為乳酸，產生大量的H+，導致pH值下降，成熟后期乳糖慢慢耗盡，產酸速度減慢，并由于蛋白質的分解，使得干酪的pH值增加[27]。發酵劑添加量對干酪pH值有顯著性影響(P<0.05)，發酵劑質量分數為1%和3%時成熟時間對pH值的影響差異極顯著(P<0.01)，但發酵劑質量分數為2%時，成熟時間對pH值的差異顯著(P<0.05)。隨發酵劑添加量的增加干酪的pH值呈現降低的趨勢，90 d時，3%和2%比1%發酵劑質量分數干酪的pH值分別降低了3.4%和1.6%。

圖1 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪pH值的影響

Fig.1 Effect of the amount of starter and ripening time on the pH value of yak milk hard cheese

注：不同小寫字母表示發酵劑添加量對其差異顯著(P < 0.05)；不同大寫字母表示成熟時間對其差異顯著(P < 0.05)。下同。

2.1.3 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪水分含量的影響

由圖2可知，成熟時間為0 d時，發酵劑質量分數為1%的水分含量與2%和3%之間存在顯著性差異(P<0.05)。發酵劑質量分數為1%～3%的3種干酪在成熟90 d的過程中變化趨勢相同，均呈下降的趨勢，分別降低了5.5%、5.1%、4.6%。成熟時間對發酵劑質量分數為1%的水分含量影響差異極顯著(P<0.01)。干酪中水分含量隨發酵劑添加量的增加而增加，90 d時3%和2%比1 %發酵劑質量分數干酪的水分含量分別高1.5%和1.3%，3%發酵劑質量分數的水分含量顯著高于1%發酵劑質量分數干酪中的水分含量(P<0.05)。

圖2 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪水分含量的影響

Fig.2 Effect of the amount of starter and ripening time on the moisture content of yak milk cheese

2.1.4 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪NaCl含量的影響

圖3 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪NaCl含量的影響

Fig.3 Effect of the amount of starter and ripening time on the NaCl content of yak milk hard cheese

干酪中添加無機鹽的目的是改善風味，并能促進乳清的排放、控制干酪的水分含量[28]。由圖3可以看出，成熟時間為0和60 d時，發酵劑質量分數為1%～3%的3種牦牛乳硬質干酪的NaCl含量之間差異極顯著(P<0.01)，0 d時3種干酪的NaCl含量分別為0.95%、0.80%、0.56%；60 d時NaCl含量分別為1.52%、1.17%、0.97%。隨發酵劑質量分數的增加，3種干酪的NaCl含量呈現下降的趨勢，90 d時3種干酪的NaCl含量分別為1.66%、1.47%、1.22%；3%比1%發酵劑質量分數干酪的NaCl含量低26.5%。在成熟90 d的過程中3種干酪的變化趨勢相同，均呈現增加的趨勢，發酵劑質量分數從1%～3%的干酪中NaCl含量分別增加了0.74%、0.67%、0.66%。發酵劑添加量和成熟時間對干酪NaCl含量的影響差異顯著(P<0.05)。

2.2 牦牛乳硬質干酪脂肪氧化降解程度

2.2.1 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪ADV值的影響

干酪的酸度值主要反映了干酪降解為游離脂肪酸的情況，是衡量乳及乳制品脂肪降解程度的一項指標[21]。由圖4得，成熟時間為0 d時，發酵劑添加量對3種牦牛乳硬質干酪的ADV值沒有顯著性影響(P>0.05)，但成熟時間為30、60、90 d時，發酵劑添加量對干酪ADV值的影響極顯著(P<0.01)。成熟時間對發酵劑質量分數為2%和3%時干酪的ADV值影響顯著(P<0.05)。在成熟90 d的過程中3種干酪(1%～3%)的變化趨勢相同，均呈現增加的趨勢，在成熟時間為90 d時ADV值分別為4.23、5.22、5.73 mg/g，是成熟時間為0 d時的2.21、2.58、2.75倍。發酵劑質量分數為1%的干酪在成熟30～60 d，ADV值增加了6.84%，增加緩慢，但在隨后的60～90 d，增加了28.96%。發酵劑質量分數為3%的干酪在成熟90 d的過程中，ADV值增加程度高，90 d時的ADV值是0 d時ADV值的2.75倍。說明增大發酵劑的添加量，干酪中脂肪氧化降解程度會隨之增加。3種干酪隨著牦牛乳硬質干酪成熟時間的延長，ADV值逐漸增大，表明干酪在成熟期間脂肪的氧化降解持續進行。

圖4 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪ADV值的影響

Fig.4 Effect of the amount of starter and ripening time on the ADV value of yak milk hard cheese

2.2.2 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪POV值的影響

POV是測定初級氧化產物-過氧化物含量的理化指標，能夠反映脂質發生一級氧化的程度。它主要是脂肪降解產生的不飽和脂肪酸中的雙鍵與環境中的氧氣發生氧化反應，形成一種中間氧化產物[29]。

由圖5可知，成熟時間為0 d時，發酵劑添加量對POV值沒有顯著性影響(P>0.05)，但隨著成熟時間的延長，發酵劑添加量對POV值的影響極顯著(P<0.01)。3種干酪的POV值隨發酵劑添加量的增加而增加，90 d時，3%比1%發酵劑質量分數干酪的POV值增加了50%。說明高發酵劑添加量可促進牦牛乳硬干酪一級氧化產物的產生。在成熟90 d的過程中3種干酪的變化趨勢相同，均呈現增加后降低的趨勢。在成熟60 d時3種干酪的POV值均為最大值，分別為1.12、1.37、1.63 meq/kg。在成熟時間90 d時，POV值顯著降低(P<0.05)，分別為0.98、1.2、1.47 meq/kg，比60 d時降低了12.50%、8.76%、9.82%。這是由于過氧化物只是脂肪氧化的初級氧化產物，它的含量決定于生成量和降解量的比率[30]，表明成熟時間可能會使初級氧化產物部分分解，從而降低了干酪中的POV值。當脂肪降解產生的一級氧化物與消耗一級氧化產物產生的小分子物質相平衡時，POV值趨于平衡。

圖5 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪POV值的影響

Fig.5 Effect of the amount of starter and ripening time on the POV value of yak milk hard cheese

2.2.3 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪CV值的影響

CV反映了干酪在成熟過程中脂肪氧化形成羰基化合物的含量，也是表示脂肪氧化程度的1個重要指標[31]。由圖6可以看出，3種牦牛乳硬質干酪在成熟時間為0 d時，發酵劑添加量對干酪的CV值影響不顯著(P>0.05)，其值分別為0.18、0.20、0.22 meq/kg。但隨著成熟時間的延長，發酵劑添加量對CV值的影響極顯著(P<0.01)，并隨發酵劑添加量的增加，CV值隨之增加。90 d時，3%發酵劑添加量的CV值是1%時的1.45倍。在成熟90 d的過程中3種干酪的變化趨勢相同，均呈現增加的趨勢，且成熟時間對CV值的影響極顯著(P<0.01)。在整個成熟過程中3種干酪的CV值分別增加了0.82、1.1、1.29 meq/kg。總之，羰基價總體呈上升趨勢，說明醛、酮、有機酸等小分子羰基化合物不斷積累，脂肪氧化程度不斷增加。

圖6 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪CV值的影響

Fig.6 Effect of the amount of starter and ripening time on the CV value of yak milk hard cheese

2.2.4 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪TBA值的影響

TBA反映了脂肪發生二級氧化的程度，表明脂肪通過氧化作用生成過氧化物后在氫氧化物的作用下進一步氧化降解生成分子量更小的醛、酸之類的化合物[32]。

圖7 發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪TBA值的影響

Fig.7 Effect of the amount of starter and ripening time on the TBA value of yak milk hard cheese

由圖7可知，3種牦牛乳硬質干酪中，發酵劑添加量和成熟時間均對干酪中TBA值有極顯著性的影響(P<0.01)。在成熟90 d的過程中3種干酪的變化趨勢相同，均呈現增加的趨勢，0 d時，干酪的TBA值分別為0.05、0.08、0.09 mg/kg，成熟90 d時，TBA值分別為0.18、0.20、0.22 mg/kg，分別增加0.13、0.12、0.13 mg/kg。3種干酪在成熟0～60 d的過程中，TBA值增加迅速，但在60～90 d的成熟過程中，TBA值的增加緩慢。隨發酵劑添加量的增加，3種干酪的TBA值隨之增加，發酵劑質量分數為3%干酪中的TBA值顯著高于1%干酪中的TBA值(P<0.05)。90 d時3%發酵劑質量分數干酪的TBA值是1%時的1.22倍；是2%時的1.10倍。表明提高發酵劑添加量能促進次級氧化產物的產生。

2.3 相關性分析

由表2可知，成熟時間對干酪中NaCl含量、ADV值、CV值和TBA值具有極強的正相關性，相關系數分別為0.81、0.92、0.91、0.94，且相關性極顯著(P<0.01)；對干酪中POV值具有強的正相關性(R=0.74)，且相關性極顯著(P<0.01)；對水分含量有強的負相關性(R=-0.68)，且相關性顯著(P<0.05)；但對干酪的pH值不具有相關性。

表2 成熟時間與干酪各指標相關性分析

注：*表示相關性顯著；**表示相關性極顯著。

3 結論

牦牛乳硬質干酪營養豐富，并且能適合中國乳糖不耐受癥，將是未來乳制品市場的新寵。但針對發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪的影響未見報道，本試驗將發酵劑添加量和成熟時間雙因素結合來研究牦牛乳硬質干酪中脂肪氧化的變化規律，以期從脂肪的氧化機制調控干酪的品質，旨在為工業化生產提供理論依據。

通過雙因素試驗可得：發酵劑添加量和成熟時間對牦牛乳硬質干酪的理化指標和脂肪氧化程度均有顯著性影響(P<0.05)。且發酵劑質量分數為3%時能夠顯著增大干酪中脂肪的氧化程度(P<0.05)，同時隨成熟時間的延長，脂肪氧化持續進行并且氧化程度也在不斷加深。