口蝦蛄金屬硫蛋白提取工藝的優化

嚴國，梅光明，顧捷，孟春英

1(浙江海洋大學 食品與醫藥學院，浙江 舟山，316021) 2(浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山，316021) 3(浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江 舟山，316021)

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸(Cys)的低分子量(6 000～7 000 Da)蛋白質，其半胱氨酸硫醇基團對重金屬具有結合能力，能夠結合多達20個單價或7個二價重金屬離子，在金屬穩態和重金屬毒性、DNA損傷和氧化應激的保護中起重要作用[1-3]，由MARGOSHES等[4]在1957年首次從馬腎中發現并分離出來。目前已從多種生物體中分離純化得到MT，包括哺乳動物(如人、大鼠、小鼠及家兔等)和一些細菌及真菌[5]。MT易與金屬結合還具備氧化還原能力，主要表現為參與生物體內微量金屬元素的儲存、運輸及代謝；對非必需重金屬也具有螯合作用；此外在調節內環境的穩態、清除自由基、防止組織氧化損傷、拮抗生理和生化反應等方面也有很重要的意義，并為其他金屬蛋白和金屬酶類提供活性中心[6-10]。因此MT在功能保健食品開發中具有十分廣泛的應用。

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)屬甲殼綱，是一種多年生大型底棲甲殼類無脊椎動物，在我國及日本、菲律賓沿海均有分布，資源量較大，2014年我國口蝦蛄產量達29.4萬t，是我國沿海地區深受歡迎的高值甲殼類產品。浙江省海洋水產研究所水產品質量安全檢測機構近年來持續的監控工作表明口蝦蛄重金屬鎘元素污染嚴重(>GB 2762—2017[11]中的0.5 mg/kg限量規定)，超標率達80%以上，砷、銅和鋅等元素也較多。大量研究證明，金屬元素的脅迫一般會誘導生物體內MT的表達，在重金屬(Ag、Cd、Cu、Hg、Zn)等誘導下，生物體內MT含量會顯著增加，且這種誘導與環境中金屬濃度具有一定的相關性[12]。任玉娟等[13]研究鎘對背角無齒蚌組織中MT含量的影響時，發現利用鎘脅迫可不同程度地使背角無齒蚌鰓和消化腺MT含量升高。彭愛紅等[14]利用不同濃度和種類的鋅鹽脅迫海洋小球藻生長并誘導其體內MT的表達，發現采用鋅離子濃度為50 μmol/L的葡萄糖酸鋅對小球藻進行脅迫培養時，誘導產生的Zn-MT含量達到最高。VINCENT等[15]研究發現，金屬硫蛋白隨著不同劑量的Cd暴露持續增加。口蝦蛄作為鎘及其他金屬元素富集能力較強的典型生物，推測其將是提取MT的良好材料，且MT可能對其在重金屬富集過程中起關鍵作用。目前對其MT的研究還沒有相關的報道，本研究以口蝦蛄為原料，對口蝦蛄MT的提取工藝進行研究，一方面為海洋生物資源的開發和利用提供新的思路，另一方面也為后續開展口蝦蛄富集鎘機理研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口蝦蛄于浙江省舟山市豐茂菜市場購買，平均體長(15.5±0.5) cm，平均體重(26.2±0.4)g。

5,5’-二硫硝基苯甲酸(DTNB)，J&K Science公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，美國Sigma公司；兔肝MT-I、MT-II標準品(純度≥95%)，博泰生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、HCl、Na2HPO4等其他試劑均為國產分析純，國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；IKA EIS-D6恒溫磁力攪拌器，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；MS 2漩渦混合器，德國IK公司；Avanti JXN-30高速冷凍型離心機，美國貝克曼庫爾特公司；AL204 型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；UV 31型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；PB 10 型pH計，賽多斯北京儀器有限公司。

1.3 實驗方法

新鮮口蝦蛄在0～4 ℃條件下洗凈去殼，取全部組織勻漿后作為樣品。先通過單因素考察，再利用響應面法優化提取條件，對提取液濃度、pH值、提取溫度和液料比等進行優化。

1.3.1 口蝦蛄MT的提取[16]

取口蝦蛄樣品，按一定量的液料比加入Tris-HCl緩沖液攪拌提取，提取液在4 ℃下以13 000 r/min高速冷凍離心25 min后，棄除沉淀，并測定上清液中MT含量。

1.3.2 MT粗品制備

(1)收集1.3.1中提取的上清液，于80 ℃水浴加熱5 min，以去除熱不穩定大分子蛋白，快速冷卻至室溫后再于4 ℃下離心分離(13 000 r/min，25 min，下同)；

(2)收集上清液后，加入3倍體積預冷的無水乙醇，-20 ℃過夜沉淀；

(3)取沉淀物在4 ℃下離心分離，棄上清液后加入23 mL Tris-HCl緩沖液，室溫下溶解3～5 h后，再于4 ℃下離心分離，收集上清液即為MT粗提液；

(4)冷凍干燥后-80 ℃保存備用。

1.3.3 單因素試驗

為了研究單因素條件對MT提取效果的影響，研究液料比[(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、10∶1(mL∶g)]、提取溫度(4、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃)、Tris-HCl緩沖液的pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、Tris-HCl緩沖液提取液濃度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L)和提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)5個因素對口蝦蛄中MT提取含量影響。

1.3.4 響應面試驗

本研究在單因素試驗的前提下，使用Design-Expert 8.06軟件中的Box-Behnken中心組合原理進行響應面試驗，研究液料比、提取液濃度、提取液pH和提取溫度4個因素對MT提取量的影響，設計L(43)試驗，優化提取條件。

表1 響應面法優化分析因素和水平表

1.3.5 DTNB法測定口蝦蛄MT含量

樣品測定和MT標準曲線的繪制參照吳云輝等[17]測定兔肝中MT含量的DTNB比色法進行。

(1)MT標準溶液配制：先配制質量濃度為1 μg/μL的MT標準品溶液，分別取不同體積的MT標準溶液加入4 mL離心管中，依次加入10 μL HCl(1.2 mol/L)和200 μL EDTA(0.1 mol/L)，于暗處反應10 min脫去金屬；再加入5 mmol/L DTNB充分渦旋3 min，使MT與DTNB形成黃色絡合物，最后用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)稀釋至4 mL，在412 nm波長下用比色法測定顯色產物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量來確定MT含量。

(2)線性回歸分析表明，MT含量在0～50 μg，回歸方程為(1)。線性關系良好，可根據此回歸方程計算樣品中MT含量。

y=0.019 7x+0.01(R2=0.998 1)

(1)

(3)實際樣品測定：取1.3.1的MT提取上清液1 mL，按1.3.5中(1)對樣品進行測定。

1.4 數據統計與分析

采用Origin 9.1、Excel、及Design-expert.V8.0.6分析處理，試驗結果均為3次重復性試驗平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

Tris-HCl緩沖液性質穩定，與生理體液具有很好的相容性，選擇Tris-HCl緩沖溶液提取，能保持MT的穩定[18-19]。由圖1可知，液料比在2～5時，MT提取量隨著提取液體積的增加而增大，在5～10，提取量大小趨于平緩，口蝦蛄中提取的MT含量維持在0.205 mg/g左右。說明在液料比達到5時，提取液已能將口蝦蛄中MT充分提取，綜合考慮試驗成本，后續試驗最佳液料比選用5進行。

圖1 液料比對MT提取含量影響

Fig.1 Effect of material-liquid ratio on MT extraction content

圖2所示為提取液濃度對MT提取含量影響，口蝦蛄中的MT提取效果隨緩沖液濃度的增大而依次減小。其中在0.01～0.02 mol/L時變化較快，0.03～0.06 mol/L時變化相對平緩，在0.02 mol/L時呈現最大值0.213 mg/g。因此初步確定最佳提取液濃度為0.02 mol/L。Tris-HCl緩沖液不僅可以作為提取溶劑，還能為離體蛋白提供相對穩定的環境，防止蛋白發生變性作用。黨蕊葉等[20]在進行兔肝MT提取液的穩定性研究時發現，緩沖液濃度在0.01、0.02 mol/L時有利于MT的提取，與本研究的結果一致。

圖2 提取液濃度對MT提取含量影響

Fig.2 Effect of extract concentration on MT extraction content

如圖3所示，在pH 6.0～9.0中，pH對于MT的提取效果具有較大影響，MT提取量呈先增加(pH 6.0～8.0)后降低(pH 8.0～9.0)的趨勢，當提取pH達到8.0時，MT提取效果最好，最大提取量為0.225 mg/g，因此初步確定最佳提取液pH值為8.0。水生生物MT的等電點(isoelectric point, pI)在pH 3.5～6.0時，如果緩沖液的pH與目標蛋白的pI相同，蛋白質就會因溶解度降低而聚集[21-22]。同時Tris-HCl溶液的pH對MT的穩定性影響很大，pH過大或過小都不利于MT的穩定，所以當pH遠離等電點時有利于MT的提取。

圖3 提取液pH對MT提取含量影響

Fig.3 Effect of extract pH on MT extraction content

溫度對提取效果影響見圖4，提取溫度在4～50 ℃，提取效果呈遞增趨勢，隨著提取溫度的升高，溶劑的分子擴散速度增強，提取率逐漸增加，并在50 ℃時得到最大提取量為0.22 4 mg/g；當溫度大于50 ℃之后，MT提取量開始呈下降趨勢，特別是在60 ℃之后迅速下降，因此初步確定50 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對MT提取含量的影響

Fig.4 Effect of extraction temperature on MT extraction content

如圖5所示，在0.5～4.0 h對口蝦蛄中MT進行提取時，發現0.5～1 h提取量逐漸增加，在提取時間1.0～4.0 h，隨著提取時間的延長，MT的提取量逐漸降低。MT為胞內功能性蛋白，其結構內富含的大量還原態巰基，是其發揮抗氧化活性最重要的作用基團，推測MT的提取量逐漸降低的原因可能是隨著提取時間的過分延長，巰基發生氧化[23]。所以當達到1 h時，MT提取量最大值為0.219 mg/g，因此確定最佳提取時間為1 h。

圖5 提取時間對MT提取含量的影響

Fig.5 Effect of extraction time on MT extraction content

2.2 響應面法對提取工藝優化

2.2.1 響應面試驗結果

在分析單因素試試驗結果后設計了響應面試驗，選擇4個對MT提取量影響顯著的因素(提取液濃度、提取液pH、提取溫度和液料比)設計四因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗，響應值為MT提取量，開展29組實驗(24組因實驗和5組中心實驗)，實驗設計及結果見表2。

利用Design-expert.V8.0.6 軟件對數據進行分析，擬合得到的二次多元回歸模型如下公式(2)：

R=0.24-0.013A-3.833E-003B-4.667E-003C-

0.014D-0.013AB+4.750E-003AC+4.250E-

003D+2.500E-004BC-7.500E-003BD+

8.000E-003CD-0.035A2-0.022B2-0.024C2-

0.013D2

(2)

從表3可知，F=10、P<0.01，表明本研究中的二次模型極其顯著，具有統計學意義。模型的失擬項的F=4.05、P>0.05，影響不顯著，說明該模型具有很好的擬合度。

表2 響應面分析試驗設計及結果

表3 提取含量二次多項模型方差分析表

注：**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著，“-”表示未測出。

從表4變異系數可以看出，模型決定系數R2=0.909 1，說明該模型能解釋90.91%的響應結果變化，其擬合度良好，誤差小，能較好地分析預測口蝦姑體內MT提取量；此外，CV=5.66%<10%，說明此研究具有較高的可信度和精確度；該模型精密度(adeq precision)>4，說明該模型可預測。因此，對口蝦蛄MT提取擬合的回歸方程符合以上檢驗原則，適應性較好。

表4 變異系數

由回歸方程的系數顯著性檢驗可知，因素A提取液pH和因素D料液比的P<0.01，說明提取液pH和D料液比對口蝦蛄中MT提取含量的影響極顯著，對于A2、B2，C2其P值均<0.01，說明A2、B2、C2對口蝦蛄中MT含量的影響也極顯著，另AB、D2的P值<0.05，說明AB、D2對口蝦蛄中MT含量具有顯著的影響，而其他因素的影響則不顯著。通過比較分析，在影響MT提取量的因素中，其影響提取效果的大小順序依次為：液料比>提取液pH>提取液濃度>提取溫度。

2.2.2 交互因子效應分析

根據所得的二元二次回歸方程分析2個因素之間的交互影響，得到交互因子的響應面和等高線圖，如圖6～圖11所示。響應面的陡度或平緩度可以反映出實驗條件變化對響應值的影響，等高線形狀可以反映相互作用強度，等高線呈橢圓形，則2個因素之間相互作用強烈，圓形則表明2因素之間交互作用較弱，等高線排列越緊密，表明對MT提取有很大的影響[24]。在同一區域中，若MT的提取量相同，則MT提取的最大值就是橢圓的中心點，其大小從中心到邊緣遞減。根據圖6～圖11可知，所有曲面圖都呈現良好的拋物線形狀，表明各因素都有明顯的相互作用，且每個曲面圖的開口都向下，證明實驗結果具有最大值。如圖7所示，從提取液pH和提取溫度交互作用的響應面圖可看出，隨著提取液pH值和提取溫度增加，MT提取量均呈先上升，上升至最大值后下降的拋物線趨勢；說明在實驗設定的提取液pH值(7.0～9.0)、提取溫度(40～60 ℃)，該模型存在最大值，即存在最佳的提取液pH和提取溫度。同樣，MT的提取量隨著提取溫度、提取液pH、液料比和提取液濃度這4個因素的變化呈相應的拋物線變化趨勢，即這4個因素都能在實驗的范圍內使得MT提取量達到最佳值。因此，在本研究中各因素水平范圍內有最優的提取條件組合，對口蝦蛄中MT也能獲得最大的提取量，通過該模型和響應面曲線圖，可以確定最佳工藝參數范圍。

圖6 提取液pH和提取溫度對MT提取量的影響

Fig.6 Effects of extraction solution pH and extraction temperature on MT extraction amount

圖7 提取液pH和提取液濃度對MT提取量的影響

Fig.7 Effects of pH extraction and extract concentration on MT extraction

圖8 提取液pH和液料比對MT提取量的影響

Fig.8 Effects of extraction solution pH and ratio of material to liquid on MT extraction

圖9 提取溫度和提取液濃度對MT提取量的影響

Fig.9 Effects of extraction temperature and concentration of extract on MT extraction amount

圖10 液料比和提取溫度對MT提取量的影響

Fig.10 the Effects of the ratio of material to liquid and extraction temperature on the extraction amount of MT

圖11 提取液濃度和液料比對MT提取量的影響

Fig.11 Effects of extraction concentration and ratio of material to liquid on MT extraction

2.2.3 響應面法最佳提取工藝驗證

依據Design-expert.V 8.0.6分析數據所得，口蝦蛄中MT最佳提取工藝條件為：Tris-HCl提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.74、提取溫度為51.04 ℃、液料比為4、提取時間為1 h，最佳響應預測結果為0.243 mg/g。結合實際，選擇Tris-HCl提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.8、液料比為4、提取溫度為51℃、提取時間1 h，在此條件下進行3次平行實驗，實際測得的MT含量為0.232 mg/g，與預測值相差0.011 mg/g，說明該模型誤差小，具有可行性，能較好地預測口蝦蛄中MT提取含量。工藝優化方法的評定標準取決于優化目標，在口蝦姑MT的提取過程中，通過對比分析，液料比在口蝦蛄中MT的提取中作為較大的影響因素；還發現A2、B2、C2其P值均<0.01，AB、D2的P值<0.05，對口蝦蛄中MT的提取量都具有顯著影響。因此，各因素跟響應值之間不僅僅是單一的線性關系。通過響應面法更好地解析各因素與響應值的相關性，尤其通過各因素的交互作用，能反映出最佳的提取工藝條件。姚冬兒等[24]利用響應面法對褶牡蠣中MT工藝優化時，結果顯示模型值與理論值之間誤差較小，獲得了良好的提取效果，為后續海洋源MT的提取開發提供了參考。李冰等[25]利用響應面法對超聲波輔助提取酵母源MT-like的工藝進行優化后，增大了MT提取效率和產量，對今后的酵母源MT-like的工業化生產具有借鑒意義。

3 結論

本研究優化了以口蝦蛄為原料提取MT的工藝，以料液比、提取液pH、提取溫度和提取液濃度為因子的數學模型，進行優化，所得的最佳提取工藝為：提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.8、液料比為4、加熱溫度為51℃、提取時間1 h，此條件下MT的提取含量為0.232 mg/g，與預測值相差0.011 mg/g，說明響應面法適用于口蝦蛄MT提取工藝進行回歸分析和參數優化。這為后續對口蝦蛄MT進行分離、純化研究提供基礎，也為海洋生物資源的開發和利用提供新的思路。