日齡對雄性伊拉兔肌肉蛋白質(zhì)組成的影響

李少博，賀稚非,2，胡穎，王澤富，李洪軍,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

兔肉因高蛋白質(zhì)、低脂肪，且低熱量、高消化率的營養(yǎng)特性[1-2]，比較符合當(dāng)代人們所追求的“營養(yǎng)與健康”的飲食理念，逐漸被世界肉類消費者所接受[3]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)據(jù)顯示[4]，2017年世界兔肉的總產(chǎn)量為148.2萬t，較2016年增長2.9%，我國繼續(xù)以93.1萬t產(chǎn)量居世界第一。

蛋白質(zhì)作為兔肉的重要組成成分，對兔肉品質(zhì)有著決定性的作用。按照溶解性的不同，肉類的蛋白質(zhì)可以分為水溶性蛋白質(zhì)、鹽溶性蛋白質(zhì)和鹽不溶性蛋白質(zhì)3大類，即肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白，其三者的組成比例直接影響著肉品的加工品質(zhì)[5]，肉品的色澤、風(fēng)味、口感和質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)特性與其蛋白質(zhì)組成情況息息相關(guān)[6]，但目前缺乏關(guān)于兔肉蛋白質(zhì)組成的詳細(xì)報道。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)特征、表達(dá)和功能的動態(tài)變化的學(xué)科[7]。近年，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了快速發(fā)展。特別是以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，因其大規(guī)模、高通量和可系統(tǒng)分析等優(yōu)點被廣為接受，shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)就是其中的代表[8]。YU等[9]利用shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了熟羊肉中蛋白質(zhì)組成的變化，證明了燒烤會降低蛋白質(zhì)的可提取性；此外，shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還被用來檢測肉中的微量污染物[10]和鑒定摻假肉制品中的生物性標(biāo)記肽[11]。盡管LIU等[12]對兔肉骨骼肌中肌質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了分析，ALMEIDA等[13]也建立了兔肉腓腸肌的第一個蛋白質(zhì)組參考圖，但是關(guān)于家兔在生長過程中蛋白質(zhì)組的變化情況還有待了解。鑒于此，本研究以雄性伊拉兔為研究對象，比較了不同日齡兔肉中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白的組成比例情況，并運用shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入探討了兔肉的蛋白質(zhì)組成，以期能為兔肉蛋白質(zhì)的研究和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性伊拉兔，重慶阿興記食品有限公司，分35、70和105三個日齡，每個日齡各10只；十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素(Urea)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)，美國Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、三氟乙酸(TFA)，美國Sigmag公司；甲酸(FA)和乙腈(ACN)(LC-MS級)，德國Merck公司；KCl、KH2PO4、HCl(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司；5430R低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；EPS601電泳儀，美國GE Healthcare公司；色譜系統(tǒng)Easy nLC、質(zhì)譜儀Q Exactive、酶標(biāo)儀Multiskcan FC，美國Thermo Scientific公司；MP Fastprep-24勻漿儀，美國MP Biomedicals公司；JY92-II超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；振蕩器Votex，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

不同日齡的兔子經(jīng)過屠宰后，立即去皮、去爪、去頭和去內(nèi)臟，然后取出背最長肌做好標(biāo)記，放入裝有冰袋的采集箱中，盡快運回實驗室。用于shotgun蛋白組學(xué)分析的樣品放在-80 ℃的冰箱中保存，其他樣品放在-20 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)的研究分析。

1.3.2 分析測定

1.3.2.1 化學(xué)成分分析

樣品中水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的測定按照AOAO[14]的方法。

1.3.2.2 氨基酸的測定

樣品中氨基酸的測定參考LUO[15]的方法，即先用酸水解法對樣品進(jìn)行處理，然后運用氨基酸自動分析儀對樣品中的天門冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)17種氨基酸進(jìn)行測定。但由于酸水解法破壞樣品中的色氨酸(Trp)，因此色氨酸的測定參考DAWOOD[16]的方法。

1.3.2.3 肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、肌基質(zhì)蛋白比例的測定

樣品中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、肌基質(zhì)蛋白的提取參考HASHIMOTO[17]的方法并稍作改動，即取25 g兔肉加入100 mL磷酸鹽緩沖液(15.6 mmol/L Na2HPO4, 3.5 mmol/L KH2PO4, pH 7.5)中，在10 000 r/min下均質(zhì)1 min，隨即將均質(zhì)液在4 ℃和5 000×g條件下離心20 min，得到上清液和沉淀，分別記為上清液I和沉淀I，然后沉淀I重復(fù)上述步驟，得到上清液II和沉淀II，將上清液I和II混合起來，向其中緩慢加入丙酮使蛋白質(zhì)沉淀，隨后將混合物在4 ℃和5 000×g條件下離心20 min，所得沉淀即為肌漿蛋白；向上述沉淀II中加入10倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L Na2HPO4, 0.05 mol/L NaH2PO4, 1.1 mol/L KCl, pH 7.5)，在10 000 r/min下均質(zhì)1 min，隨即將均質(zhì)液在4 ℃和5 000×g條件下離心20 min，得到上清液III和沉淀III。上清液III備用，然后將沉淀III重復(fù)上述步驟得到上清液Ⅳ和沉淀Ⅳ，上清液Ⅳ備用，而沉淀IV即為肌基質(zhì)蛋白。將上清液III和IV在4 ℃下用去離子水透析48 h，得到的固體物即為肌原纖維蛋白，最后運用凱氏定氮法對蛋白進(jìn)行定量分析。3種蛋白質(zhì)的比例按照公式(1)、(2)、(3)進(jìn)行計算：

(1)

(2)

P3/%=1-P1-P2

(3)

式中：P1,P2和P3分別代表樣品中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白占總蛋白的比例，P肌漿蛋白,P肌原纖維蛋白和P總蛋白分別代表樣品中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和總蛋白的含量。

1.3.2.4 肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白氨基酸組成的分析

將70日齡伊拉兔中的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白按照1.3.2.3的方法進(jìn)行提取，然后真空冷凍干燥24 h后參考1.3.2.2中的方法對其進(jìn)行氨基酸分析。

1.3.2.5 Shotgun蛋白組學(xué)分析

樣品處理：參考ZHU[18]的方法對兔肉進(jìn)行處理，即向兔肉中加入適量SDT裂解液(4% SDS, 150 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L DTT, pH 8.0)，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有適量石英砂的離心管中，再應(yīng)用勻漿儀對其進(jìn)行勻漿破碎，超聲處理(80 W，工作10 s，間歇15 s，循環(huán)10次)后在沸水浴中保持15 min。然后在離心力為14 000×g的條件下離心40 min，最后取上清液采用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液，采用BCA法對濾液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。對樣品進(jìn)行分裝，并于-80 ℃條件下保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：各樣品分別取20 μg蛋白質(zhì)，分別加入5倍上樣緩沖液(10% SDS, 0.5% 溴酚藍(lán), 50%甘油, 500 mmol/L DTT, 250 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8)，沸水浴保持5 min后進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳(恒流14 mA，90 min)，最后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

FASP酶解[19]：取30 μL蛋白質(zhì)溶液，分別加入DTT溶液至終蛋白質(zhì)濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min后冷卻至室溫；再加入200 μL UA buffer(8 mol/L urea, 150 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)混勻后轉(zhuǎn)入10 kDa的超濾離心管中，在14 000×g的條件下離心 15 min，除去濾液(重復(fù)該步驟1次)；加入100 μL IAA buffer，600 r/min振蕩1 min，在室溫避光條件下反應(yīng)30 min，然后以14 000×g離心 15 min；隨后加入100 μL UA緩沖液在14 000×g的條件下離心15 min，重復(fù)該步驟2次；加入100 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液在離心力為14 000×g的條件下離心 15 min，重復(fù)該步驟2次；加入40 μL胰蛋白酶緩沖液(4 μg胰蛋白酶溶于 40 μL 100 mmol/L NH4HCO3)，以600 r/min振蕩1 min后在37 ℃下放置 16～18 h；隨后換新收集管，在14 000×g的條件下離心 15 min；再加入40 μL 25 mmol/L NH4HCO3，以14 000×g離心15 min，收集濾液。最后采用C18柱對肽段進(jìn)行脫鹽處理，在肽段凍干后加入40 μL 0.1% FA溶液復(fù)溶，隨后進(jìn)行肽段定量分析。

質(zhì)譜分析：樣品采用納升流速的高效液相色譜系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1% FA水溶液，B液為0.1% FA-ACN水溶液(ACN為84%)。色譜柱用95%的A液平衡，流速為300 nL/min。樣品經(jīng)高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時長為60min，檢測方式為正離子，母離子掃描范圍m/z300～1 800。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；用MaxQuant 1.5.3.17對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用Origin 8.0和Photoshop CS6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 日齡對兔肉營養(yǎng)成分的影響

不同日齡伊拉兔肌肉的營養(yǎng)成分如表1所示。新鮮兔肉中水分含量通常在70%～77%，并且肉中的水分和脂肪含量往往存在著一定程度的負(fù)相關(guān)，即水分含量高的肉中脂肪含量較低，反之亦然[20]。由表1可知，35日齡的伊拉兔肌肉中的水分含量顯著高于105日齡(P<0.05)，105日齡的伊拉兔肌肉中脂肪含量顯著高于35日齡(P<0.05)，與METZGER[21]的研究結(jié)果相一致，可見，年齡會顯著影響兔肉中的水分和脂肪含量。在3個日齡組中，105日齡伊拉兔的肌肉中灰分含量最高(P<0.05)。蛋白質(zhì)作為肌肉的主要組成成分，其含量的多少直接影響著肉的品質(zhì)，如肉的嫩度、多汁性和顏色等，從而影響消費者對肉制品的整體接受度[22]。從表1中可以看出，35日齡的伊拉兔肌肉中的蛋白質(zhì)含量顯著低于其他2個日齡(P<0.05)，這主要是由不同日齡兔肉中水分含量的差異引起的[23]。

表1 不同日齡伊拉兔肌肉的營養(yǎng)成分

注：不同小寫字母表示不同日齡之間有顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.2 日齡對兔肉蛋白質(zhì)構(gòu)成的影響

雄性伊拉兔肌肉的蛋白質(zhì)構(gòu)成如圖1所示。一般而言，蛋白質(zhì)的構(gòu)成對肉的品質(zhì)有著決定性的作用，特別是肌原纖維蛋白，它主要負(fù)責(zé)肌肉的收縮特性，影響肉制品的質(zhì)構(gòu)、嫩度和保水性[24]。本研究中，伊拉兔肌肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白占總蛋白的32.32%和57.35%，且其不受日齡的影響(P>0.05)；這與TOMBERG[25]結(jié)果相一致，他發(fā)現(xiàn)肌肉中肌漿蛋白占總蛋白的30%～35%，肌原纖維蛋白占總蛋白的55%～60%。肌基質(zhì)蛋白作為肌肉蛋白質(zhì)的另一重要組成部分，主要由膠原蛋白組成，與肉的嫩度息息相關(guān)。從圖1可以看出，雄性伊拉兔肌肉中肌基質(zhì)蛋白占總蛋白的比例受到日齡的影響比較顯著(P<0.05)，這是因為隨著日齡的增加，其膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和數(shù)量也會發(fā)生相應(yīng)的變化[26]。此外，伊拉兔肌肉中肌基質(zhì)蛋白占總蛋白的10.33%，高于魚肉中的比例3%～5%[27]，側(cè)面驗證了魚肉嫩度高于兔肉。

圖1 不同日齡伊拉兔肌肉的蛋白質(zhì)構(gòu)成

Fig.1 The protein quantity of meat samples from different old rabbits

2.3 伊拉兔肌肉中不同類型蛋白質(zhì)的氨基酸組成

肌漿蛋白主要是由參與肌肉收縮的酶和肌紅蛋白組成[28]；肌原纖維蛋白主要由肌動蛋白和肌球蛋白等蛋白組成[29]；膠原蛋白是肌基質(zhì)蛋白的主要成分。每種蛋白質(zhì)都有其獨特的氨基酸組成，所以肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白的氨基酸組成存在著差異。可以看出，肌原纖維蛋白的必需氨基酸含量最高，達(dá)到了41.67 g/100 g蛋白質(zhì)。Lys和Glu分別是蛋白質(zhì)中含量最高的必需氨基酸和非必需氨基酸，這與2.4中的研究結(jié)果一致。除Glu外，肌基質(zhì)蛋白中非必需氨基酸Pro、Ala和Gly的含量較高，這主要是因為Ala、Pro和Gly是膠原蛋白的主要組成氨基酸，膠原蛋白是肌基質(zhì)蛋白的主體成分[30]。

表2 不同類型蛋白質(zhì)的氨基酸含量

2.4 日齡對兔肉氨基酸組成的影響

從表3中可以看出，日齡對伊拉兔肌肉中部分氨基酸的含量有顯著影響。與35日齡的伊拉兔相比，105日齡的伊拉兔肌肉中含有較高的Leu、Tyr、Pro、Asp、Ala、Arg，較低的Thr和Ser(P<0.05)，這主要與它們食物的原料不同有關(guān)，35日齡的伊拉兔剛剛斷奶，母乳是它們的主要食物來源，105日齡的伊拉兔則以商業(yè)飼料為主，其食物營養(yǎng)成分的不同導(dǎo)致了它們肌肉氨基酸組成的差異。這一研究結(jié)果與BIVOLARSKI[31]相似，他發(fā)現(xiàn)家兔斷奶日齡顯著影響兔肉蛋白質(zhì)的生物價值和氨基酸組成。食物的不同也會顯著影響脂肪酸組成[32]、感官特性[33]等理化品質(zhì)。必需氨基酸作為生物體的必需物質(zhì)，經(jīng)常被用來評價蛋白質(zhì)的生物價值[34]。伊拉兔肌肉中必需氨基酸的平均含量為9.10 g/100 g肉，其中Lys的含量最高，達(dá)到了2.25 g/100 g肉；在非必需氨基酸中Glu的含量最高，達(dá)到了2.59 g/100 g肉。可見，兔肉蛋白質(zhì)具有較高的生物價值，是人體必需氨基酸的良好來源。

表3 不同日齡伊拉兔肌肉的氨基酸含量

2.5 日齡對兔肉蛋白質(zhì)組成的影響

2.5.1 不同日齡伊拉兔肌肉中特有蛋白質(zhì)的組成

如圖2所示，在雄性伊拉兔背最長肌中共檢測出790種蛋白質(zhì)，并且每個日齡都有其特定的蛋白質(zhì)，其中35日齡的兔肉含有的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，這主要是因為兔肉在生長過程中部分基因的表達(dá)發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的合成出現(xiàn)差異[35]。TELTATHUM[36]也發(fā)現(xiàn)年齡越小的雞，其肌肉中含有的蛋白質(zhì)數(shù)量越多。35日齡的伊拉兔肌肉中共發(fā)現(xiàn)96種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)大部分都參與機(jī)體的生理代謝過程，例如G1U3l5(烯酰輔酶A水合酶1)和G1SWU1(琥珀酰輔酶A: 3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶)，還有部分蛋白質(zhì)擁有特定的分子功能，如離子結(jié)合和酶蛋白結(jié)合等。此外，70日齡和105日齡的伊拉兔肌肉中分別發(fā)現(xiàn)23和7種特定蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)大部分具有分子結(jié)合功能，參與機(jī)體的代謝過程，還有部分蛋白質(zhì)是細(xì)胞骨架的主要組成成分，對保持細(xì)胞的正常生理活動起著重要作用。

A-蛋白質(zhì)數(shù)量；B-特有蛋白質(zhì)的ID號，其中圓形、正方形和五邊形分別代表35、70和105日齡伊拉兔肌肉中的特有蛋白質(zhì)

圖2 不同日齡伊拉兔肌肉的蛋白質(zhì)組成

Fig.2 Protein profile of meat samples from Ira rabbit of different ages

2.5.2 不同日齡伊拉兔肌肉中含有的共同蛋白質(zhì)組成情況

從圖2得出，有512種蛋白質(zhì)共同存在于35、70和105日齡的伊拉兔肌肉中，這些蛋白質(zhì)的分子功能如圖3所示。在這些共同蛋白質(zhì)中，有接近2/3的蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合和核酸結(jié)合功能，還有一部分蛋白質(zhì)與機(jī)體內(nèi)酶的活性息息相關(guān)，這些蛋白質(zhì)主要參與機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)運輸和生化反應(yīng)等，對機(jī)體正常的生理生命活動有著決定性的作用。同時，種類功能豐富的蛋白質(zhì)組成也間接地表明了在動物體內(nèi)肌肉是代謝高度活躍的組織之一，這與YU[37]的研究結(jié)果相一致。

圖3 不同日齡伊拉兔肌肉中共同蛋白質(zhì)的分子功能分布

Fig.3 Molecular function of the common proteins identified in meat samples from Ira rabbit of three ages

3 結(jié)論

伊拉兔肌肉中含有豐富的蛋白質(zhì)，是必需氨基酸的良好來源；日齡會顯著影響兔肉肌基質(zhì)蛋白的含量以及肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和肌基質(zhì)蛋白的氨基酸組成；同時，采用shotgun蛋白組學(xué)技術(shù)在兔肉中共檢測出790種蛋白質(zhì)，并且日齡顯著影響其蛋白質(zhì)組成，35日齡的伊拉兔肌肉中特有蛋白數(shù)量最多，然而這些蛋白與兔肉質(zhì)量之間的關(guān)系還需進(jìn)一步的深入研究。