超聲波對反復凍融雞肉肌原纖維蛋白功能特性的修復作用

張伊儂，董唯，徐毅,2,3，尚永彪,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

冷凍是生鮮肉制品最有效、最常用的貯藏手段。然而在實際生產中，冷鏈技術并不完善，肉類從屠宰、加工到零售等環節中，外界溫度波動較大，產品會不可避免地經受反復凍融[1]，造成內部冰晶體重結晶，破壞細胞組織的結構，造成營養物質流失，并加快蛋白質的冷凍變性，同時產品的色澤、保水性和質構也會發生變化，肉的食用價值及加工品質大大降低，給屠宰和深加工企業帶來極大的損失。近年來，越來越多的學者開始關注并嘗試解決反復凍融給鮮肉品質帶來的問題。祝凱麗[2]發現，隨著反復凍融次數的增加，生鮮肉的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)含量、乳化性、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性都呈降低的趨勢，蛋白質的凝膠化作用也受到影響，但添加海藻酸鈉的MP再經過同樣凍融處理后，其變性情況得到明顯改善。郭銳等[3]將κ-卡拉膠和復合磷酸鹽添加到反復凍融豬肉中制成香腸，與對照組相比，處理組香腸的出品率和保水性顯著提高，其質構性能以及內部水分分布也有所改善。目前來看，關于改善反復凍融肉制品的品質的研究大多是采用預防的措施，即在肉品發生凍融之前預先加入添加劑，以防凍融后蛋白質特性受到較大影響，但此類方法不適用于已經發生凍融損傷的肉制品，有較大的局限性。

研究表明，超聲波能改變蛋白質的構造，引起蛋白質次級結構發生變化，進而改變蛋白質的功能特性[4]。然而，目前應用物理方法處理反復凍融肉制品的研究鮮有報道。本文采用超聲波對反復凍融雞肉進行處理，考察其對MP的功能特性的處理效果，并進一步探究超聲波處理對MP功能特性修復的機理，以期為反復凍融肉類原料的科學利用、改善深加工產品的品質、提高加工出品率和企業經濟效益等提供一定的技術和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，選取同批次新鮮白羽雞的雞胸肉，購于重慶市北碚區永輝超市；大豆油，益海嘉里食品有限公司，購于重慶市北碚區永輝超市；牛血清蛋白標品、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、EDTA、CuSO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

HFJ-25內切式勻漿機，天津市恒奧科技發展有限公司；GL-23MS高速冷凍離心機，湖南賽特湘儀有限公司；CT-3質構儀，美國Brookfield公司；HR-1流變儀，美國TA公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Spectrun100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

將購置的新鮮雞胸肉去除可見的脂肪及結締組織，切成均勻的小塊狀，用塑料冷凍包裝袋真空包裝(每袋約200 g)后，放入-18 ℃冰箱中凍藏3 d，然后約10 ℃室溫解凍12 h。如此反復凍融5次，制備試驗所需的雞肉樣品。

1.3.2 MP的提取以及超聲波處理

MP的提取參考董唯[5]的方法，提取出的MP保藏在4 ℃冰箱中，使用時間不超過3 d。進行超聲波處理時，取適量MP于離心管中，采用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液根據各指標的測定方法分別調整蛋白質濃度，然后將離心管固定于超聲清洗器中，超聲功率設定為420 W，溫度保持在40 ℃，超聲處理時間分別為0、3、6、9、12、15、18 min，然后進行相關指標的測定。

1.3.3 MP溶解度的測定

用雙縮脲法測定蛋白質的濃度[6]，以牛血清蛋白為標準品，所得標準曲線方程為：y=0.076 5x+0.002 6，R2=0.999 8。MP溶解度的計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 MP乳化活性和乳化穩定性的測定

用4℃磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質量濃度為1 mg/mL的MP溶液，經超聲波處理后，其乳化性的測定參照AGYARE等[7]的方法進行。

1.3.5 起泡性的測定

參照JIANG等[8]的方法并作適當的修改。用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質量濃度為1 mg/mL的MP溶液，樣品經超聲波處理后，取10 mL樣液高速勻漿，相關指標按公式(2)和公式(3)計算。

(2)

(3)

式中：V，樣品的初始體積，mL；V0，勻漿后立即測得的泡沫體積，mL；V0.5，勻漿后樣品靜置0.5 h后泡沫的體積，mL。

1.3.6 MP熱誘導凝膠的制備

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2HPO4，pH 6.25)配制質量濃度為40 mg/mL的MP溶液，經超聲波處理后，取7 mL樣品于10 mL的離心管中，將其在40℃下水浴20 min，然后在80 ℃下再水浴30 min。操作完成后將離心管放入冰水中，使其快速降溫，從而縮短凝膠形成的時間。制備好的MP凝膠應放在4 ℃的冰箱中過夜后再使用。

1.3.7 凝膠硬度和彈性的測定

取出制備好的凝膠樣品，在室溫下放置30 min，去除表面水分，將凝膠樣品修整為約1 cm厚的規則圓柱體，測定凝膠硬度和彈性，具體參數的設置參照董唯[5]的方法。

1.3.8 凝膠保水性的測定

取出制備好的凝膠樣品，室溫下放置30 min后，將凝膠進行離心并記錄相關質量，保水性的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：m0，離心管的質量，g；m1，離心前凝膠和離心管的質量，g；m2，離心后并去除水分后凝膠和離心管的質量，g。

1.3.9 MP流變學特性的測定

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2HPO4，pH 6.25)配制質量濃度為40 mg/mL的MP溶液，經超聲波處理后，參考白登榮等[9]的方法設定流變儀的參數。

1.3.10 MP粒徑大小的測定

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCI，20 mmol/L Na2HPO4，pH 6.5)配制質量濃度為1 mg/mL的MP溶液，經超聲波處理后，使用激光粒度儀測定蛋白質溶液中粒子大小。具體設定參數參考崔姍姍[10]的方法。

1.3.11 MP凝膠巰基含量的測定

稱取10 g凝膠樣品溶解于25 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液A中，均質離心后取上清液，并將其蛋白質質量濃度調至1 mg/mL。取0.5 mL蛋白質溶液與5 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液B混合，再加入0.1 mL DTNB(0.01 mol/L)，40 ℃條件下保溫25 min后在412 nm處測定溶液的吸光度，計算總巰基含量。緩沖液的配制具體參照ELLMAN[11]的方法。總巰基含量的計算如公式(5)所示：

C0=(A/ε)×(D/ρ)

(5)

式中：C0，總巰基的摩爾濃度，mol/g；A，吸光值；ε，吸光系數為13 600 M-1cm-1；D，稀釋倍數；ρ，上清液中蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.3.12 MP SDS-PAGE凝膠電泳

用不連續的SDS-PAGE對雞肉MP進行分析，具體操作及參數設置參考LAEMMLI[12]的方法。

1.3.13 紫外光譜分析

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質量濃度為1 mg/mL的MP溶液，樣品經超聲波處理后進行紫外掃描，其速率設定為10 nm/s，掃描波長為200～600 nm。

1.3.14 紅外光譜分析

提取的MP溶液經超聲波處理后，需先制成MP凍干樣品，然后與KBr一起研磨成粉末，制成壓片。具體操作方法及測定條件參考林婉玲等[13]的方法。

1.3.15 數據處理

試驗重復3次，最終結果取平均值。用Excel 2016對數據進行處理，用Origin 8.1軟件進行繪圖，用SPSS Statistics 17.0對數據進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 超聲波對MP功能特性的影響

反復凍融的MP經不同時間超聲波處理后部分功能特性變化情況如表1所示。由表1可知，經超聲波處理后，從MP的水合性質、表面性質和凝膠性質3方面測得的各指標均顯著大于對照組(P<0.05)，蛋白質功能特性得到很大改善。超聲波的空化效應和機械效應能對蛋白質分子之間的相互作用產生影響[14]，隨著超聲波處理樣品時間的變化，MP分子間的次級鍵也會隨之不停地發生斷裂或者重新建立，蛋白質結構發生改變，相應的功能特性也因此發生變化。超聲波使MP分子鏈慢慢打開，從有序的卷曲緊密結構變為無序松散的伸展狀態，原本隱藏在結構內部的親水基團更多地暴露，形成更易溶于水的非共價鍵分子，水合能力增強，溶解度提高。而蛋白質的溶解度又與其他功能特性密切相關，比如，溶解度的增加能夠促進體系中參與乳化作用的蛋白質濃度增加，使油水界面形成更厚的蛋白膜，提高蛋白質乳化性[15]。MP的凝膠特性隨超聲波處理時間的延長先升高后降低，在12 min時有很好的硬度、彈性及保水性，可能是因為超聲波使MP中非共價鍵作用力增強，凝膠網絡結構結合地更致密、均勻；但是，如果超聲波處理時間過長(>12 min)，可能會產生過高的局部熱量，導致部分蛋白質改變構象發生聚集，部分功能性基團被包埋在蛋白質顆粒內部，從而使形成的凝膠結構無序而粗糙，凝膠性質下降。

表1 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.2 超聲波對MP流變學特性的影響

如圖1所示,隨著超聲波處理時間的增加，MP的G′值先增加后降低，并在12和15min時有較高的G′值。在升溫的第1階段，在41～43 ℃時出現了第1個峰值，MP分子被打開，蛋白質凝膠網絡形成，未經超聲波處理的蛋白質樣品在43.17 ℃時G′達到最大值，為1 236.4 Pa，而超聲波處理組的蛋白質樣品出現峰值的時間縮短，且其G′最大值顯著大于未經超聲波處理；在第2階段48～50 ℃時出現了第2個峰值，超聲波處理的樣品的G′最小值顯著大于對照組，而且其轉變溫度低于對照組；第3階段是隨著溫度的升高，G′值迅速增大，在71～77 ℃時出現了第3個峰值，此時形成了不可逆凝膠，未經超聲波處理的蛋白質樣品G′在77.10 ℃時達到最大值，而時間為12 min處理組的蛋白質樣品G′在73.91 ℃達到最大值34 130.4 Pa，時間為15 min處理組的蛋白質樣品G′在74.26℃達到最大值32 392 Pa。與未經超聲波處理的蛋白質樣品相比，超聲波處理的樣品G′值增大速度較快，G′值發生轉變的溫度點比未經超聲波處理組低，且其G′最大值也顯著高于未經超聲波處理組，這表明超聲波處理可以降低蛋白質形成凝膠的熱變性溫度，提高凝膠的形成能力，這與凝膠彈性和硬度測得結果基本一致。

圖1 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白存儲模量(G′)的影響

Fig.1 Effects of ultrasonic time on storage modulus (G′)of myofibrillar protein

2.3 超聲波對MP粒度的影響

如圖2所示,隨著超聲波處理時間的增加，MP平均粒徑呈減小的趨勢,當處理時間為0～12 min時，超聲波對MP平均粒徑減小的作用十分顯著(P<0.05)，在超聲波處理時間為12 min時，蛋白質的平均粒徑達到最小值，為1 315 nm；處理時間超過12 min后粒徑變化不顯著。HU等[16]用高強度超聲波處理大豆蛋白時，發現超聲波處理減小了蛋白質顆粒尺寸，且處理時間越長，粒徑越小；ZHANG等[17]研究超聲波處理花生蛋白時也發現5、10、15、20、25、30 min超聲處理組的蛋白質的平均粒徑比對照組顯著減小。WU等發現[18]，蛋白質的粒徑大小與蛋白質凝膠性質密切相關，當MP粒徑較小時，更有利于形成致密均勻的凝膠網絡結構。本研究中MP凝膠特性以及MP粒徑變化趨勢與WU等[18]的觀點相符，由此可見，強烈的振蕩作用及剪切力使蛋白質分子間非共價相互作用遭到破壞，其顆粒被分散和破碎，有利于MP凝膠特性的提高。

圖2 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白平均粒徑的影響

Fig.2 Effects of ultrasonic time on particle size of myofibrillar protein

2.4 超聲波對MP分子質量的影響

不同超聲時間處理后的MP經SDS-PAGE分析，結果如圖3所示，7個時間梯度所處理的MP樣品的電泳條帶無明顯變化，表明處理前后MP的分子質量(主要是肌球蛋白和肌動蛋白)分布沒有發生明顯變化，即MP的一級結構可能沒有明顯發生變化，而發生改變的應該是MP的高級結構。常海霞等[19]采用不同時間超聲波處理草魚肌肉MP時，發現處理時間的變化并不會引起MP電泳譜帶較大的變化，也未出現蛋白質降解片段或蛋白質共價聚集產物，這與本文結論相似。

M-標準蛋白(marker)；1～7-超聲波處理時間分別為0、3、6、9、12、15、18 min

圖3 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白SDS-PAGE

圖譜的影響

Fig.3 Effects of ultrasonic time on the SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein

2.5 超聲波對MP巰基含量的影響

如圖4所示，隨著超聲時間的增加，MP凝膠巰基含量顯著下降(P<0.05)。與對照組相比，經超聲處理3、6、9、12、15、18 min后，其蛋白質凝膠巰基分別由對照組的7.11×10-5mol/g降低至6.99×10-5mol/g、6.76×10-5mol/g、6.48×10-5mol/g、6.22×10-5mol/g、6.08×10-5mol/g、5.91×10-5mol/g，分別降低了1.69%、4.92%、8.86%、12.51%、14.49%、16.47%。這一變化可能與超聲波對MP分子鏈的打開作用有關，超聲波處理使包埋在分子內部的巰基暴露出來，而巰基基團與二硫鍵這一維持蛋白質特定結構穩定性的共價鍵密切相關，所以某種程度上，巰基含量的降低說明MP分子內的二硫鍵重新發生鍵合，這也必定會導致MP結構改變[20]。劉亞春[21]采用不同方法處理豬肉肌原纖維蛋白，對凝膠機理進行研究時，發現超聲波處理組的熱誘導蛋白質凝膠巰基含量比空白組要低，認為超聲波通過物理作用使巰基轉變為二硫鍵，導致了巰基含量下降。

圖4 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白凝膠巰基含量的影響

Fig.4 Effects of ultrasonic time on sulfhydryl content of gelatin from myofibrillar protein

2.6 超聲波對MP紫外光譜的影響

如圖5所示，隨著超聲時間的增加，MP的紫外吸光度呈先增加后降低的趨勢，處理時間為12 min時紫外吸光度達到最大值。隨著處理時間進一步增加，紫外吸光度略有降低，2個吸收峰分別位于250和270 nm左右。MP產生紫外光譜的原因主要是因為其分子內部某些殘基的側鏈基團可以吸收紫外光，如色氨酸和組氨酸等，其次肽鍵也可以吸收紫外光[22]。而當樣品經超聲波處理后，MP分子構象改變，其中的生色基團被更多地暴露到了表面，相對含量提高，且這些生色基團由原來所處的非極性環境轉換為極性環境，從而使體系紫外吸光度增加[18]。而超聲波處理時間過長時(>12 min)，蛋白質分子可能又會發生聚集，生色基團相對減少，蛋白質紫外吸光度降低。紫外光譜的變化進一步說明超聲波使MP分子結構發生了變化，從而引起其功能特性相應的改變。

圖5 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響

Fig.5 Effects of ultrasonic time on the UV spectra of myofibrillar protein

2.7 超聲波對MP紅外光譜的影響

不同超聲波處理時間對MP紅外光譜及二級結構含量變化的影響如圖6所示。通常蛋白質的α-螺旋和β-折疊被包埋在多肽鏈的內部，其中α-螺旋結構緊密且無空腔，是非常穩定的二級結構[23]。隨著處理時間的增加，MP中α-螺旋結構的含量顯著降低(P<0.05)，說明其對超聲波處理比較敏感。β-折疊含量呈先增加后降低的趨勢，而β-轉角、無規則卷曲含量有所增加。MP二級結構組成中有序單元(α-螺旋結構和β-折疊結構)的總含量也呈下降趨勢，表明超聲波處理時間越長，MP二級結構改變的越多。β-折疊結構易優先轉化為β-轉角，本研究中β-轉角含量明顯增加，說明隨著超聲波處理的進行，蛋白質結構變得更加松散[24]，MP分子中螺旋結構部分展開，剛性結構減少，柔性結構增加，促使蛋白質柔順性增強，這也可能是促使MP某些功能性質(如溶解性、乳化性、起泡性等)改善的內在因素。蛋白質中無規則卷曲結構含量增加，可能是由于α-螺旋逐漸解旋轉化，MP的構象緊密性與穩定性也因此大大降低。包埋于分子內部的疏水性殘基暴露出來，增強了肌球蛋白分子間的疏水相互作用，引起蛋白質的聚合[25]。

圖6 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白二級結構含量的影響

Fig.6 Effects of ultrasonic time on secondary structure content of myofibrillar protein

3 結論

經適當超聲波處理后的反復凍融雞肉肌原纖維蛋白，其溶解性、乳化性、起泡性及凝膠特性均得到顯著改善(P<0.05)。通過對MP粒徑的測定發現，超聲波的機械效應和空穴效應產生的強烈的振蕩作用及剪切力，使蛋白質分子打開，顆粒分散和破碎，粒徑減小；與此同時，MP的結構發生變化，巰基含量減少，被氧化為二硫鍵；通過對紫外光譜的測定也發現原本埋藏在分子內部的生色基團暴露，蛋白質三級結構改變；進一步測定紅外光譜表明，分子中α-螺旋和β-折疊都有所減少，蛋白質結構變得更加松散。而隨著超聲波處理時間的延長，約超過12～15 min時，蛋白質可能會發生變性，造成其再次聚集，顆粒變大，影響蛋白質形成的致密均勻的凝膠網絡結構。而通過凝膠電泳的測定，發現處理前后變化不明顯，說明超聲波對MP的修復作用與分子量的影響不大。