沙棘果酒發酵動力學及其抗氧化活性

張琪，朱丹，牛廣財*，魏文毅，顏飛翔

1(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319) 2(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶，163319)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科沙棘屬植物。沙棘果實中含有Vc、類胡蘿卜素、黃酮類化合物、多酚類化合物，以及豐富的不飽和脂肪酸、氨基酸等營養成分[1-3]，具有增強人體免疫力、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗輻射、預防心腦血管疾病以及美容護膚等作用[4-6]。我國是世界上沙棘屬植物類群分布最多的國家，沙棘總面積占世界的95%以上。將沙棘發酵成沙棘酒，是其精深加工的一個方向。目前對沙棘酒的研究多集中于其發酵過程中生物活性物質變化和發酵工藝，如賀靜[7]研究了沙棘酒主發酵過程中不同處理條件下類胡蘿卜素、多酚及抗氧化性變化；牛廣財等[8]采用Folin-Ciocalteu比色法測定了沙棘酒中總多酚含量；蔡文超等[9]采用響應面法優化了沙棘酒的發酵工藝，在此工藝條件下，所發酵沙棘酒的酒精度為12.0% vol。但是，尚未發現有關沙棘酒發酵過程中的酒精生成、基質糖消耗及酵母菌體生長規律方面的研究。

發酵動力學是對微生物生長和產物形成過程的定量描述，研究發酵過程中菌體的生長、底物消耗和產物合成之間的動態平衡及內在規律。胡永正對桑葚酒發酵過程中菌體生長、底物消耗和產物生成情況進行Logistic模型的非線性擬合，擬合效果較好，有利于其工業化發酵生產[10]。通過相應發酵動力學模型，可以對發酵過程進行定量分析和對實驗最終指標進行預測。吳樹坤等采用SGompertz模型、DoseResp模型、Boltzmanm模型對不同發酵時間山葡萄發酵液中酵母生長期數量的變化、酒精生成情況及還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發酵動力學模型，判定系數R2均大于0.995，能較好地描述發酵中的動力學特征[11]。

本試驗采用經典的DoseResp模型、Boltzmann模型、SGompertz模型和Logistic模型，對沙棘果酒發酵過程中酵母生長期數量的變化、酒精生成和還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發酵動力學模型，為沙棘果酒實現工業化生產提供幫助。同時，本試驗還測定了不同發酵時間沙棘果酒中總多酚、總黃酮和Vc含量，結合1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 法、總抗氧化能力試劑盒法測定不同發酵時間沙棘果酒抗氧化活性。通過對沙棘果酒發酵動力學和抗氧化活性研究，為沙棘果酒發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍沙棘果，深秋紅俄羅斯大果沙棘，總糖含量65.02 mg/mL，總酸含量17.82 g/L，pH值為3.0，購于黑龍江省孫吳縣大果沙棘展銷中心。RV171型葡萄酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，黑龍江北方糖業股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

Pectinex XXL果膠酶(酶活10 000 U/mL)，諾維信(中國)生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、VC標準品，國藥集團化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，草酸，2,6-二氯靛酚鈉，NaOH，無水乙醇，Al(NO3)3，NaNO2，無水甲醇，福林酚，Na2CO3等，均為國產分析純；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

WS108手持式折光儀，河北潤聯科技開發有限公司；HR7633打漿機，飛利浦家庭電器(珠海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計，上海凌析達儀器；L420臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養箱；YS100尼康生物顯微鏡，日本尼康公司；EX324電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 沙棘果酒發酵工藝流程與操作要點

工藝流程如下：

冷凍沙棘果→打漿→酶解→調整糖度→殺菌→接種→發酵→恒溫培養→沙棘果酒→分析測定

操作要點：

(1)將冷凍沙棘果在室溫下進行解凍后，用打漿機打漿，測其可溶性固形物的含量[12]。

(2)用果膠酶進行酶解，溫度為45～50 ℃，酶解時間是3 h[13]。

(3)加白砂糖調整糖度至21 °Brix[14]。

(4) 活化酵母菌：用1/3的沙棘汁和2/3的蒸餾水溶解干酵母，在35 ℃下將酵母菌活化30 min。

(5)接種前在60 ℃條件下殺菌30 min，然后冷卻至室溫，接入質量濃度5 g/L活化好的酵母菌，于21 ℃條件下恒溫發酵。每24 h取樣1次，取發酵液離心后的上清液進行檢測，3次重復。

1.4 發酵動力學數據的測定

1.4.1 酵母菌數量測定

將發酵液取出用蒸餾水稀釋一定倍數，滴于血球計數板上，在光學顯微鏡下直接計數。

1.4.2 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS)比色法測定還原糖的質量濃度[15]。葡萄糖標準曲線方程為：y=0.538 9x-0.016 1，R2=0.997 2。

1.4.3 酒精度測定

采用蒸餾法和密度瓶法測定沙棘果酒的酒精度數[16]。

1.5 總多酚、總黃酮與Vc含量的測定

1.5.1 總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定沙棘果酒中的總多酚的含量[17]。沒食子酸標準曲線方程為：

y=0.179 2x+0.088 7，R2=0.998 6

根據標準曲線及樣品吸光度，計算出發酵液總多酚的含量。

1.5.2 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定沙棘果酒中總黃酮的含量[18]。蘆丁標準曲線方程為：

y=0.080 2x+0.004 7，R2=0.997 5

根據標準曲線及樣品吸光度，計算出發酵液總黃酮的含量。

1.5.3 Vc含量的測定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[19]。

1.6 抗氧化性測定

1.6.1 DPPH自由基清除能力測定

采用李治龍等[20]的方法略有改動。配制DPPH溶液：用電子天平稱取19.7 mg DPPH，然后用體積分數95%乙醇溶解后直接定容至100 mL，得到DPPH溶液，濃度為0.5 mmol/mL，配制好的溶液于0～4 ℃下避光保存。取2 mL稀釋后的樣液與0.5 mL DPPH溶液混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Ai；取2 mL無水甲醇與0.5 mL DPPH溶液混合，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Ac；取2 mL處理好的樣液與0.5 mL無水甲醇混合，混合均勻后37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Aj。按照公式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：Ai，加發酵液反應后DPPH溶液的吸光度；Ac，加DPPH溶液，不加發酵液的吸光度；Aj，加發酵液，不加DPPH溶液的吸光度。

1.6.2 總抗氧化能力的測定

參考韋云路等的方法[21]，總抗氧化能力測定采用總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)測定試劑盒方法。

1.7 數據處理與分析

每組實驗進行3次重復，采用Origin 9.0軟件進行作圖分析，再選取適合的模型對酵母菌數量、酒精度以及還原糖含量進行非線性擬合。比較擬合相關系數，選取擬合度高的模型進行定量描述。

2 結果與分析

2.1 沙棘果酒發酵過程中酵母菌數量、酒精度以及還原糖含量的變化

由圖1可知，酵母菌在24～96 h增長速度較快，為快速增長期，隨后數量變化幅度較大，進入穩定期和衰亡期。到96 h左右時酵母菌數最高值達到7.8×108CFU/mL，96 h后，酵母菌數量逐漸減少，其原因是在較高酒精濃度和較低還原糖濃度下進入平穩期而衰亡[22]，出現菌體自溶和沉淀。還原糖含量隨著發酵時間的增長而下降，0～192 h還原糖消耗速度較快，由酵母菌轉化為酒精，192 h后基本保持穩定。酒精度數呈逐漸升高的趨勢，在0～192 h升高較快，192 h后增幅變緩，在264 h時酒精度達到最高，為11.7% vol。表明在沙棘汁發酵過程中，酒精的生成與還原糖的消耗是對應的。

圖1 沙棘果酒發酵過程中酒精度、酵母菌數、還原糖含量變化規律

Fig.1 Changes of alcohol content, yeast count, and reducing sugar content during fermentation of sea buckthorn wine

2.2 沙棘果酒的發酵動力學模型

2.2.1 酵母菌數生長動力學模型

表1 酵母菌數的擬合方程及其相關系數

由圖1可知，酵母菌在96 h后開始進入衰亡期，因此，本研究擬對發酵0～120 h時期酵母菌生長情況進行非線性擬合(見表1)。對比SGompertz模型、DoseResp模型及Logistic模型的擬合相關系數，SGompertz模型對酵母菌生長情況擬合效果最好，相關系數R2為0.956 2。故選用SGompertz模型。

對沙棘果酒酵母菌數的生長情況進行擬合，得到擬合曲線如圖2所示。由圖2可知，酵母菌在沙棘果酒發酵24 h后生長速率開始提高，在96 h時菌體數量達到最高值。

圖2 SGompertz模型下酵母菌生長擬合曲線

Fig.2 Fitting curve of yeast growth in the SGompertz model

2.2.2 酒精生成動力學模型

如表2所示，得出3種模型的擬合相關系數分別是0.995 1、0.991 5、0.992 1，可知Boltzmann模型擬合的效果最佳，所以，最終選取Boltzmann模型為沙棘果酒發酵中酒精生成的擬合模型。圖3是Boltzmann模型的擬合曲線。

表2 酒精生成擬合方程及相關系數

圖3 Boltzmann模型下酒精生成擬合曲線

Fig.3 Fitting curve of alcohol formation in the Boltzmann model

由圖3可知，酒精度在192 h后趨于平緩，最大值為11.7% vol。

2.2.3 還原糖消耗動力學模型

由表3可知，對比Boltzmann模型、DoseResp模型與Logistic模型這3種模型的擬合相關系數，Boltzmann模型和DoseResp模型擬合效果最好，相關系數R2均為0.979 6。因此，選取Boltzmann模型和DoseResp模型來擬合沙棘果酒發酵過程中的還原糖消耗過程。

表3 還原糖消耗擬合方程及相關系數

圖4 Boltzmann模型下還原糖消耗擬合曲線

Fig.4 Fitting curve of reducing sugar consumption in the Boltzmann model

圖5 DoseResp模型下還原糖消耗擬合曲線

Fig.5 Fitting curve of reducing sugar consumption in the DoseResp model

由圖4和圖5可知，在216 h之前，還原糖的消耗較快，之后消耗量放緩。這與吳樹坤擬合模型一致[11]。

2.3 總多酚、總黃酮和Vc含量的變化

2.3.1 沙棘果酒發酵過程中總多酚含量的變化

由圖6可知，總多酚含量呈先上升后下降的趨勢，發酵時間在24～96 h為沙棘果酒最主要發酵階段，此時沙棘果酒的出汁量比較多，可能是酵母菌把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質，使得總多酚含量升高，沙棘果酒的總多酚含量由初始的61.75 mg/mL增長為146.01 mg/mL。在96 h之后的發酵中，總多酚含量開始逐漸下降，可能酵母菌生長代謝過程中產生了一些次級代謝產物，導致總多酚物質發生氧化、聚合或沉淀等反應，還可能是果酒利用總多酚物質發生褐變反應，造成總多酚含量下降。此結論與李雪等[14]關于仙人掌果酒發酵過程和于立梅等[22]在研究山竹酒發酵過程中的總多酚變化趨勢的結論一致。

圖6 沙棘果酒發酵過程中總多酚含量的變化

Fig.6 Changes of total polyphenols content during fermentation of sea buckthorn wine

2.3.2 沙棘果酒發酵過程中總黃酮含量的變化

由圖7可知，沙棘果酒發酵過程中總黃酮含量呈先上升后降低的趨勢。在24～72 h，總黃酮含量不斷上升，在72 h時達到了最高值(12.60 mg/mL)。其原因可能是隨著發酵的進行，沙棘果大量出汁，酒精度不斷增加，使得黃酮類物質不斷浸出，有利于醪液中黃酮的提取，且浸泡時間延長，黃酮的溶解量也不斷增加。

圖7 沙棘果酒發酵過程中總黃酮含量的變化

Fig.7 Changes of total flavone content during fermentation of sea buckthorn wine

但是，在發酵后期，總黃酮含量呈下降趨勢，可能是由于沙棘果酒在發酵過程中，丙酮酸、乙醛等酵母釋放的次級代謝產物會與黃酮類物質發生反應，生成一些大分子衍生物所致，還可能是發酵后期多酚自身分解及氧化導致多酚黃酮含量下降[23]。

2.3.3 沙棘果酒發酵過程中Vc含量的變化

由圖8可知，Vc含量呈現先增加后減少的趨勢，與總多酚含量的變化趨勢一致。當發酵至96 h左右，Vc含量達到最大值，為27.47 mg/100 mL。可能酶解處理沙棘果使其細胞壁被破壞，內容物流出以及隨著發酵時間的延長，乙醇含量增加，活性物質增多，包括Vc含量升高。之后Vc含量開始逐漸降低，這可能是發酵后期Vc氧化和發生不同程度的降解所致。

圖8 沙棘果酒發酵過程中VC含量的變化

Fig.8 Changes of vitamin C content during fermentation of sea buckthorn wine

2.4 沙棘果酒發酵過程中抗氧化性的變化

2.4.1 沙棘果酒發酵過程中DPPH自由基清除率變化

圖9 沙棘果酒發酵過程中DPPH自由基清除率的變化

Fig.9 Changes of DPPH radical scavenging rate during fermentation of sea buckthorn wine

由圖9可知，DPPH自由基清除率呈現先增加后減少的趨勢。這是因為隨著發酵時間的不斷增加，自身的抗氧化物質不斷浸出，總多酚含量逐漸增加[24]，FEREIDOON等認為酚類物質很容易給出一個氫離子并通過共振雜化而穩定，是其具有高自由基清除能力的主要原因[25]，這使得其對DPPH自由基清除率較強；在發酵72～120 h是發酵的較佳時期，是清除率較高階段。在72 h時，沙棘果酒對DPPH自由基清除率最大，達到了76.12%；在120 h之后，DPPH自由基清除率則呈下降趨勢，可能是在發酵的過程中，果酒中的多酚類物質與Vc含量降低，從而導致DPPH自由基清除能力下降[26]。

2.4.2 發酵過程中總抗氧化能力的變化

由圖10可知，沙棘果酒在發酵過程中總抗氧化能力呈現先上升后降低趨勢，與DPPH自由基清除率的變化相似。在發酵120 h時，總抗氧化能力達到最大，為145.53 U/mL。可能是隨著總多酚和Vc含量的增加，提高了沙棘果酒的抗氧化能力[27]；在發酵120 h之后，由于活性成分含量的逐漸下降，最終導致其總抗氧化能力下降[28]。

圖10 沙棘果酒發酵過程中總抗氧化能力的變化

Fig.10 Changes of total antioxidant capacity during fermentation of sea buckthorn wine

3 結論

SGompertz模型、Boltzmann模型、DoseResp模型及Boltzmann模型能較好地對酵母菌生長、酒精生成和還原糖消耗進行非線性擬合，所選模型能較好地模擬沙棘果酒的發酵過程及描述其發酵動力學特征；沙棘果酒發酵過程中的總多酚含量、總黃酮含量、Vc含量、DPPH清除率以及總抗氧化能力均呈前期快速增加，后期逐漸下降的峰型變化趨勢，其最大值分別達到了146.01、12.60、27.47 mg/100 mL、76.12%和145.53 U/mL。