天芷金黃凝膠貼膏提取工藝的優(yōu)化

譚娥玉， 關(guān)琴笑， 王賢兒， 馬少鋒， 林信亨， 湯啟勛

（江門市五邑中醫(yī)院， 廣東 江門529000）

天芷金黃凝膠貼膏源自如意金黃散, 載于《外科正宗》, 由黃柏、 大黃、 姜黃、 天花粉、 白芷、 厚樸、 陳皮、甘草、 蒼術(shù)、 天南星10 味中藥組成[1], 具有清熱解毒、 消腫止痛之功效, 用于熱毒瘀滯肌膚所致瘡瘍腫痛、 丹毒流注, 癥見膚紅、 腫、 熱、 痛, 亦可用于跌打損傷[2]。 該方在臨床上使用的主要劑型為散劑和膏劑, 但均存在操作繁瑣、 攜帶不便、 易于污染衣物等諸多缺點, 為了滿足臨床需求, 本課題組擬將其制成更為輕便的凝膠貼膏。

由于天芷金黃凝膠貼膏藥味較多, 成分復雜, 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制尚未明確, 故為了保證制劑療效, 本實驗選擇方中3 味主藥（黃柏、 大黃、 姜黃）[3-5], 以其有效成分（鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚） 含有量及出膏率為評價指標, 層次分析法確定各指標權(quán)重系數(shù), 結(jié)合正交試驗優(yōu)化提取工藝, 為該制劑開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 InfinityⅡ型HPLC 色譜儀, 配置四元泵、 自動進樣器、 柱溫箱、 DAD 檢測器、 色譜工作站（美國Agilent 公司）； ME104 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司]； WH-800 超聲波清洗機（濟寧萬和超聲電子設備有限公司, 800 W、 40 kHz）； Best-S30超純水機（芷昂儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 天花粉、 黃柏、 大黃、 姜黃、 白芷、 厚樸、 陳皮、 甘草、 蒼術(shù)、 制天南星均購自廣州市集芝寶中藥有限公司。 鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院, 批號0713-9906, 含有量98.14%）； 姜黃素 （批號MUST-17050310, 含有量99.27%）、 蘆薈大黃素 （批號MUST-17030605, 含 有 量 98.76%）、 大 黃 酚 （ 批 號 MUST-17041310, 含 有 量 99.50%）、 大 黃 素 （ 批 號 MUST-17102702, 含有量99.48%）、 大黃素甲醚 （批號MUST-17102702, 含有量99.00%） 對照品（成都曼思特生物科技有限公司）。 甲醇為色譜純； 二氯甲烷、 磷酸、 鹽酸均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標成分含有量測定

2.1.1 色譜條件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm, 4 μm）； 流動相甲醇（A） -0.1% 磷酸（B）, 梯度洗脫（0 ～2 min, 53% A； 2 ～2.01 min, 53% ～78%A； 2.01 ～5.00 min, 78% A； 5.00 ～6.00 min, 78% ～82%A； 6～15 min, 82%A）； 檢測波長254 nm （鹽酸小檗堿、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚）、 430 nm（姜黃素）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量5 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量, 加甲醇制成每1 mL 分別含鹽酸小檗堿0.162 5 mg、 姜黃素0.126 0 mg、 蘆薈大黃素0.012 0 mg、 大黃素0.021 6 mg、大黃酚0.030 4 mg、 大黃素甲醚0.022 4 mg 的溶液, 即得。

2.1.2.2 供試品溶液 精密量取醇提液20 mL, 水浴蒸干, 加入25 mL 8% 鹽酸, 超聲10 min, 二氯甲烷萃取3次, 每次25 mL, 合并二氯甲烷層, 水浴蒸干, 殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中, 甲醇稀釋至刻度, 搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾, 即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 取缺黃柏、 姜黃、 大黃的陰性樣品, 按“2.1.2.2” 項下方法制備, 即得。

2.1.3 系統(tǒng)適應性試驗 取對照品、 供試品、 陰性樣品溶液適量, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 結(jié)果見圖1。 由圖可知, 供試品色譜在與對照品相應位置上有相同色譜峰, 陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、 2、 4、 6、8、 10 μL, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。 以峰面積為縱坐標（Y）, 進樣量為橫坐標（X） 進行回歸, 結(jié)果見表1, 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.1.5 定量限、 檢測限 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液適量, 倍比稀釋, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 分別按信噪比10 ∶1、 3 ∶1 計算定量限、 檢測限。 結(jié)果, 鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、大黃素甲醚定量限分別為2.59、 3.17、 0.18、 0.30、 0.15、0.11 ng, 檢測限分別為0.78、 0.95、 0.05、 0.09、 0.05、0.03 ng。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液5 μL, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次, 測得鹽酸小檗堿、姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚峰面積RSD 分別為0.52%、 0.46%、 1.90%、 0.61%、 0.46%、0.44%, 表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一提取液適量, 按“2.1.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚峰面積RSD 分別為0.97%、1.15%、 1.19%、 0.95%、 0.50%、 1.32%, 表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液, 于0、 2、 4、 8、16、 24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚峰面積RSD 分別為0.65%、 0.57%、 1.25%、 0.81%、0.75%、 1.27%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含有量已知（鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素 甲 醚 含 有 量 分 別 為 132.7、 95.45、 16.79、 21.02、35.60、 15.83 μg/mL） 的供試品溶液5 mL, 共6 份, 置于10 mL 量瓶中, 精密加入“2.1.2” 項下對照品溶液5 mL,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 計算回收率。 結(jié)果,鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚平均加樣回收率分別為100.8%、 99.68%、98.09%、 100.6%、 97.70%、 98.75%, RSD 分別為1.93%、1.97%、 2.08%、 1.36%、 1.91%、 2.16%。

2.2 出膏率測定 精密吸取醇提液10 mL, 置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中, 水浴蒸干, 置105 ℃烘箱中干燥3 h, 取出, 置于干燥器中冷卻30 min, 迅速取出, 精密稱定質(zhì)量,計算出膏率, 公式為出膏率=（所得浸膏凈重/藥材量）×100%。

2.3 層次分析法[6-9]根據(jù)中藥君臣佐使配伍規(guī)律及各成分藥理作用強弱, 本實驗將鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚含有量和出膏率作為權(quán)重指標予以量化, 確定優(yōu)先順序為鹽酸小檗堿含有量=姜黃素含有量=大黃酚含有量＞蘆薈大黃素含有量=大黃素含有量=大黃素甲醚含有量＞出膏率, 構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣, 見表2。 再根據(jù)矩陣表對數(shù)據(jù)作歸一化計算, 得各指標成分權(quán)重系數(shù)分別為0.237 1、 0.237 1、 0.088 1、0.088 1、 0.237 1、 0.088 1、 0.024 4, 一致性比率因 子CR=0.013 6＜0.1, 表明指標優(yōu)先比較判斷矩陣具有滿意的一致性, 權(quán)重系數(shù)有效。

表2 指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

2.4 正交試驗 單因素試驗確定了提取次數(shù)為2 次, 在預試驗基礎(chǔ)上, 選擇乙醇體積分數(shù)（A）、 料液比（B）、 提取時間（C） 作為影響因素, 進行L9（34） 正交試驗, 因素水平見表3。 再以鹽酸小檗堿、 姜黃素、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素、 大黃素甲醚含有量及出膏率為評價指標,稱取藥材粉末9 份, 每份9.75 g, 回流提取2 次, 抽濾,合并2 次濾液, 定容至250 mL, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定, 按“2.2” 項下方法計算出膏率, 歸一化法計算各指標分值, 計算綜合評分, 通過方差分析、 直觀分析優(yōu)選提取工藝, 結(jié)果見表4, 方差分析見表5。

表3 因素水平

表4 試驗設計與結(jié)果

表5 方差分析

由表4 可知, 各因素影響程度依次為A＞B＞C, 即乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間； 由表5 可知, 因素A 對提取效果具有顯著影響（P＜0.05）, 而因素B、 C 無顯著影響（P＞0.05）, 最優(yōu)工藝為A3B2C1, 即10 倍量80%乙醇回流提取2 次, 每次30 min。

2.5 驗證試驗 精密稱取處方量藥材3 份, 按照優(yōu)化工藝條件進行驗證試驗, 結(jié)果見表6, 可知該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

基于層次分析法在評價中藥制劑工藝的優(yōu)勢[10-11], 本實驗采用該方法確定各指標權(quán)重系數(shù), 在各項指標兩兩比較判斷矩陣中, 黃柏、 大黃、 姜黃在方中藥量相同, 三者主要發(fā)揮了清熱解毒、 消腫止痛之功效, 故其中主要有效成分鹽酸小檗堿、 大黃酚姜黃素最為重要, 計分最高； 大黃中蘆薈大黃素、 大黃素、 大黃素甲醚含有量較大黃酚低,重要程度次于大黃酚, 計分次之； 多糖、 淀粉、 鞣質(zhì)、 樹膠、 樹脂等出膏較多的成分并非本實驗提取的目標, 故出膏率重要程度更低。

本實驗色譜條件中的流動相體系參考文獻[12-14] 及藥典中大黃[2]、 姜黃[2]含有量測定的條件, 最終確定采用甲醇-0.1%磷酸體系, 經(jīng)多次預試驗調(diào)整梯度洗脫, 各待測組分色譜峰與相鄰色譜峰均達到基線分離, 峰形較好。由于采用DAD 檢測器, 參比波長360 nm, 故色譜圖上任意時間點、 波長下的信號值都可理解為該時間點在選定波長、360 nm 波長下吸光度的差, 如254 nm 下姜黃素呈現(xiàn)倒峰,430 nm 下鹽酸小檗堿呈現(xiàn)倒峰, 表明2 種成分分別在254、430 nm 處的吸光度小于360 nm 處。 另外, 由于各指標成分最大吸收波長差異較大, 為了使其均有較高響應值, 最終采用雙波長檢測, 在254 nm 處測定鹽酸小檗堿、 蘆薈大黃素、 大黃素, 大黃酚, 大黃素甲醚, 在430 nm 處測定姜黃素。

表6 驗證試驗結(jié)果（n=3）

本實驗采用優(yōu)化工藝制備醇提液, 選擇聚丙烯酸鈉（NP-800）、 甘羥鋁、 甘油、 酒石酸、 羧甲基纖維素鈉等作為基質(zhì), 將劑型改造為凝膠貼膏, 可大大提高臨床使用便利性。 但制成凝膠貼膏后其臨床有效性是否受到影響尚不明確, 仍有待于今后通過透皮吸收、 臨床療效實驗進行驗證。