五味子乙素對缺血誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究

布 斐 苗玉珠

（陽谷縣人民醫(yī)院口腔科，山東 聊城 252300）

五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是從中藥五味子中提取得到的天然化合物之一，其具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡的作用[1-3]。可以增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的含量，增強(qiáng)各種抗氧化酶的活性，同時(shí)可以增強(qiáng)線粒體的功能和結(jié)構(gòu)的完整性，對細(xì)胞損傷均有一定的保護(hù)作用[4-8]。但是五味子乙素對人牙髓細(xì)胞的影響及作用機(jī)制尚無定論。本研究通過LPS對體外培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性以及FAK、ERK、Akt表達(dá)的影響，旨在通過FAK/ERK/Akt信號通路探討脂多糖（LPS）對缺血誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料。試劑：牙髓細(xì)胞是選取25歲以下因正畸原因拔出無病變牙的患者的牙髓組織；五味子乙素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號W-001-500）；MTT、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白抗體一抗、二抗均購自美國Signal公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TransGen公司；RTPCR試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：收集25歲以下因正畸原因拔出無病變牙的患者的牙髓組織，無菌條件下將其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于含有15%FBS H-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在條件為37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察牙髓細(xì)胞的形態(tài)及生長情況；細(xì)胞生長融合至80%～90%的時(shí)候，采用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代。選取第3～5代牙髓細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)染色鑒定

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：選取生長狀態(tài)良好的第3～5代牙髓細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的密度將其接種于帶有細(xì)胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每孔體積為500 μL。待細(xì)胞貼壁后將其分為6組，藥物組分別加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的五味子乙素，空白對照組不添加任何誘導(dǎo)劑。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖率：采用MTT法檢測五味子乙素對牙髓細(xì)胞增殖率的影響。選取生長狀態(tài)良好的第3～5代牙髓細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的密度將其接種于帶有細(xì)胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每孔體積為500 μL，藥物組的五味子乙素的濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同時(shí)以等體積H-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)液作為空白對照組，各組重復(fù)3孔。收集五味子乙素處理48 h后的各組細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞周期同步化。離心收集細(xì)胞，沿壁管緩緩加入預(yù)冷的70%的乙醇，固定過夜。加入少量PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，去乙醇液，洗2遍，再加入0.5 mL的PBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNasea至終濃度為50 μg/mL，室溫避光孵育30 min，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡的情況，得到4個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖，一式3份。

1.4.2 RT-PCR檢測牙髓細(xì)胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA的表達(dá)量：選取生長狀態(tài)良好的第3～5代牙髓細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的密度將其接種于帶有細(xì)胞蓋玻片的48孔板中，在條件為37 ℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每孔體積為500 μL，加入含有15%FBS H-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，藥物組的五味子乙素的濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同時(shí)以等體積H-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)液作為空白對照組，各組重復(fù)3孔。提取細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將cDNA置于-20 ℃中備用。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃反應(yīng)60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃反應(yīng)5 min，每組進(jìn)行3次獨(dú)立測定，圖像分析儀掃描凝膠密度，分析得到mRNA的相對含量。

1.4.3 Western blot檢測牙髓細(xì)胞中FAK、ERK、AKT的表達(dá)：采用western blot（WB）檢測不同濃度五味子乙素對牙髓細(xì)胞中FAK、ERK、AKT的表達(dá)的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用s）表示，使用單因素方差分析或t檢驗(yàn)對不同分組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 牙髓細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)5 d后可以發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞從牙髓組織周圍爬出，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)長梭形漩渦狀排列，進(jìn)行傳代后的細(xì)胞狀態(tài)比較穩(wěn)定。化學(xué)染色鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳代后的細(xì)胞波形蛋白染色結(jié)果顯示陽性，角蛋白染色結(jié)果顯示陰性，結(jié)果說明此細(xì)胞來源于中胚層，具有牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性。

2.2 五味子乙素對細(xì)胞增殖率的影響：結(jié)果顯示，不同濃度的五味子乙素分別處理牙髓細(xì)胞24、48、72 h后，各藥物組細(xì)胞增殖率均高于無藥物組（P<0.01），牙髓細(xì)胞的增殖率隨著五味子乙素濃度的增加以及藥物作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，且與藥物濃度和時(shí)間呈現(xiàn)一定的依賴性。見表1。

表1 五味子乙素對細(xì)胞增殖率的影響

表1 五味子乙素對細(xì)胞增殖率的影響

注：與無藥物組相比，**P<0.01

處理時(shí)間 24 h(%) 48 h(%) 72 h(%)0 μmol/L 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.625 μmol/L 18.83±5.74 ** 23.97±4.87 ** 29.76±5.33 **1.25 μmol/L 26.73±3.88 ** 36.26±3.90 ** 38.59±4.02 **2.5 μmol/L 34.65±4.62 ** 53.23±4.36 ** 66.92±3.96 **5 μmol/L 62.51±5.57 ** 76.68±7.27 ** 86.72±9.37 **10 μmol/L 82.64±8.56 ** 88.67±7.78 ** 89.56±8.39 **P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 五味子乙素對細(xì)胞凋亡的影響：與空白對照組相比，不同濃度的五味子乙素處理牙髓細(xì)胞后，各藥物組細(xì)胞的總凋亡率明顯下降（P<0.01），且與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 五味子乙素對牙髓細(xì)胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA相對表達(dá)量的影響：不同濃度五味子乙素處理牙髓細(xì)胞后，藥物組細(xì)胞中的ALP、DSPP、TGF-β1mRNA相對表達(dá)量均高于空白對照組（P<0.05和P<0.01），且與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HtrA1的mRNA相對表達(dá)量雖然也高于空白對照組，但是與五味子乙素的藥物濃度的優(yōu)勢不顯著。

2.5 五味子乙素對牙髓細(xì)胞中FAK、ERK、AKT表達(dá)的影響：Wstern blot結(jié)果顯示，不同濃度五味子乙素處理牙髓細(xì)胞后，藥物組細(xì)胞中的FAK、ERK、AKT的表達(dá)顯著高于空白對照組（P<0.05和P<0.01），且與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等的作用，能夠抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善阿爾茨海默癥小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、還可以抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡[4-5]。但是五味子乙素對缺血誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞的增殖、凋亡等的影響以及其可能的作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究通過FAK/ERK/AKT信號通路探討五味子乙素對缺血誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度五味子乙素處理牙髓細(xì)胞后，隨著五味子乙素濃度的增加牙髓細(xì)胞的增殖率呈現(xiàn)上升趨勢，而牙髓細(xì)胞凋亡率明顯下降，藥物組細(xì)胞中的FAK、ERK、AKT的表達(dá)顯著高于空白對照組，且與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性。

細(xì)胞的增殖和凋亡一直是一種平衡狀態(tài)存在于機(jī)體內(nèi)，這種平衡一旦被打破就會引起一些病變的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)的基因與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展有著直接的關(guān)系，然而細(xì)胞外的因素主要是可以通過一些信號傳導(dǎo)因子作用于細(xì)胞內(nèi)的金銀，從而間接地影響了細(xì)胞的凋亡和增殖，許多信號通路參與了牙髓細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程[6]。FAK作為一種蛋白質(zhì)底物，是細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的主要信號介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK對人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞骨架組織有一定的影響[7-8]，因此，五味子乙素可能通過激活FAK信號來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架元素的動(dòng)態(tài)變形和細(xì)胞凋亡。AKT是FAK下游靶點(diǎn)，在五味子乙素的作用下，由于FAK信號被激活引起ERK/AKT等下游信號被轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]]。在本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以使牙髓細(xì)胞中FAK、ERK、AKT的表達(dá)增強(qiáng)。