自配液基保存液在免疫細胞化學染色輔助細胞學診斷肺癌中的應用▲

韋榮干 葉秋容 周敏燕 黎 莉 黃佳珍 韋黎黎 莫祥蘭 黃謨婉

(廣西壯族自治區人民醫院1 病理科，2 呼吸內科，南寧市 530021，電子郵箱：weironggan@163.com)

細胞學檢查是診斷肺癌的主要方法之一，但肺癌的細胞學分型與組織學分型結果不盡一致，臨床實踐中可因活檢取材不滿意(如取材不到位、壞死組織多、腫瘤細胞少、組織擠壓變形等)，造成診斷困難或不能分類，進而延誤治療[1]。細胞學如能準確地診斷和分型既可以彌補活檢的不足，又避免了再次取材的麻煩，也給一些晚期不適合手術的肺癌患者提供治療的依據。良好的細胞涂片是細胞學檢查的根本，其對診斷的準確性和及時性至關重要。傳統細胞涂片由于受到涂片厚薄不一，血液、黏液、炎癥細胞干擾，涂片固定不及時等諸多因素的影響，較難對肺癌進行診斷分型[2]。隨著液基細胞學的引入，細胞學的診斷水平有了較大的提高[3]，有文獻報道，應用液基細胞制片進行免疫細胞化學染色(immunocytochemistry,ICC)輔助細胞學診斷肺癌的效果良好，但商品化的液基耗材成本較高，限制了其在細胞學診斷上的應用。本文采用自配液基保存液(以下簡稱“保存液”)保存纖維支氣管鏡(以下簡稱“纖支鏡”)刷檢和沖洗液的細胞學標本，液基制片后行ICC輔助細胞學診斷，并探討該技術在肺癌細胞分型中的應用效果，以尋找一種經濟實用、簡單方便、效果理想、適合普及推廣的液基制片方法，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2013年6月至2014年7月我院纖支鏡室送檢的74份刷檢和沖洗液標本，細胞學診斷均為肺癌，其中包含62例非小細胞癌和12例未能鑒別為低分化鱗癌、低分化腺癌或小細胞癌的肺癌標本，其中60例得到明確的組織學肺癌分型結果(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細胞癌)。患者年齡31～89歲，中位年齡58歲；男46例，女28例。所有患者在纖支鏡檢查前均未進行放療和化療，細胞學診斷和組織學診斷由不同的醫師獨立完成。

1.2 主要試劑和設備 非小細胞癌采用抗體p63(p63基因)(批號：130506365E,140513365E)、細胞角蛋白(cytokeratin，CK)5/6(批號：130518276C,140420276C)、CK7(批號：130513166C,140402166C)和甲狀腺轉錄因子1(thyroid transcription factor 1，TTF-1)(批號：130217599C,140505599C)進行鱗癌和腺癌的鑒別診斷，低分化鱗癌、低分化腺癌和小細胞癌采用抗體p63、CK5/6、CK7、TTF-1、突觸素(synaptophysin,Syn)(批號：130418171B,140410171B)和神經細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)56(又稱CD56)(批號：130525256C,140417256C)進行鑒別診斷。以上抗體和本研究所用的免疫組化試劑盒(批號：1305069903,1404289903)均購自福州邁新公司。保存液的成分包含磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和乙醇，將三者混溶后室溫保存備用。離心制片機(型號：BDY-YJ)由武漢博達康激光電子設備有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 液基細胞制片：纖支鏡刷檢和沖洗液標本離體后均立即置于25 mL保存液中保存并送檢。標本以1 500 r/min離心10 min，棄上清液，按沉淀量加入適量的10%二硫代蘇糖醇(按10 ∶1比例)，充分搖勻至黏液完全溶解，加入30 mL保存液后震蕩3 min以清洗標本，1 500 r/min離心10 min，棄上清液并用保存液重懸標本沉淀制成濃度約20%的懸液，用離心制片法制成細胞涂片1張，剩余懸液保存于4℃冰箱。細胞涂片濕固定于95%乙醇15 min后進行巴氏染色，行細胞學診斷。對不能確定類型的含癌細胞標本，用離心制片法制作細胞涂片，涂片晾干后置于4℃丙酮中固定1 h，取出晾干后放入-20℃冰箱保存，用于ICC進行肺癌分型，ICC的具體操作步驟參照試劑說明書進行。

1.3.2 ICC分組：將細胞學診斷為非小細胞癌的但有明確組織學診斷的53例患者標本歸為Ⅰ組,分別標記抗體p63、CK5/6、CK7和TTF-1。將7例未能鑒別為低分化鱗癌、低分化腺癌或小細胞癌的分化較差但有明確組織學診斷的癌細胞標本歸入Ⅱ組，分別標記抗體p63、CK5/6、CK7、TTF-1、Syn和CD56。

1.3.3 ICC陽性判斷：抗體在癌細胞著色部位：CK7、CK5/6著色于細胞質和細胞膜，Syn著色于細胞質，CD56著色于細胞膜，TTF-1和p63著色于細胞核。按著色強度判斷，未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按著色細胞數量判斷，癌細胞著色細胞數0%～5%為0分，著色細胞數6%～10%為1分，著色細胞數11%～25%為2分，著色細胞數>25%為3分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，7～9分為強陽性(+++)。

1.5 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異具有統計學意義。細胞學診斷與組織學診斷結果的一致性分析采用Kappa值檢驗，以Kappa值<0.4為一致性較差，0.4≤Kappa值≤0.7為一致性中等，Kappa值>0.7為一致性高。

2 結 果

2.1 細胞學+ICC檢查與組織學對肺癌分型的一致性 以組織學結果為金標準，60例經組織學檢查已明確肺癌分型的標本中(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細胞癌，其中Ⅰ組鱗癌8例、腺癌45例，Ⅱ組鱗癌2例、腺癌2例、小細胞癌3例)，細胞學+ICC分型結果如下：Ⅰ組診斷鱗癌8例、腺癌40例，5例因所選抗體全陰性未能進一步分類；Ⅱ組診斷鱗癌3例、腺癌2例、小細胞癌2例。Kappa一致性檢驗結果顯示Kappa值=0.762，說明用保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液標本，可較好保存細胞抗原，使細胞學聯合相關抗體對肺癌分型的結果與組織學分型的一致性較高。細胞學+ICC肺癌分型與組織學分型的比較見表1。

表1 細胞學+ICC分型結果與組織學的比較(n)

2.2 不同免疫細胞標志物在肺癌分型中的應用價值 以組織學結果為金標準，60例經組織學檢查已明確肺癌分型的標本(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細胞癌)中，經ICC檢測p63、CK5/6對鱗癌的敏感度分別為80.0%和100.0%，CK7、TTF-1對腺癌的敏感度分別為85.1%和63.8%。在ICCⅡ組中，組織學診斷為小細胞癌的3例患者，ICC檢測中Syn和CD56陽性各2例，敏感度均為66.7%。各抗體與組織學對肺癌分型結果見表2～表5，各抗體對肺癌分型的結果見圖1。

圖1 各抗體對肺癌分型的結果

注：① CK5/6對肺鱗癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；② p63對肺鱗癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；③ CK7對肺腺癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；④ TTF-1對肺腺癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；⑤ Syn對肺小細胞癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；⑥ CD56對肺小細胞癌的分型[(+++),EnVision法,×400]。

表2 p63的ICC檢測與組織學診斷肺鱗癌的結果比較(n)

表3 CK5/6的ICC檢測與組織學診斷肺鱗癌的結果比較(n)

表4 CK7的ICC檢測與組織學診斷肺腺癌的結果比較(n)

表5 TTF-1的ICC檢測與組織學診斷肺腺癌的結果比較(n)

3 討 論

細胞涂片巴氏染色對部分非角化型鱗癌與腺癌的鑒別，以及對低分化癌或分化較差的癌細胞的分型比較困難，加上傳統細胞涂片存在厚薄不均、細胞不集中、ICC染色時細胞易脫落等問題，均不利于ICC在細胞學診斷上的應用，導致細胞學診斷時難以對疾病類型進行分型[4]。液基細胞涂片克服了傳統涂片的上述弊病，同時剩余標本可以置于保存液中備用，有利于后續用于細胞學的其他檢測。本研究應用自配液基保存液制作細胞涂片，在整個ICC過程中沒有出現細胞脫落現象，陽性著色定位準確，無非特異性著色。

肺癌的靶向治療要求病理診斷做到分型明確，免疫組化在肺癌分型中扮演著重要的角色[5]。研究顯示，p63、CK5/6對肺鱗癌有較高的敏感性和特異性，而CK7、TTF-1則對肺腺癌有較高的敏感性和特異性[6-7]，CK7、TTF-1可以聯合其他抗體鑒別肺腺癌的原發性和轉移性[8]。Syn、CD56是神經內分泌癌免疫組化常用的標記物，文獻報道，Syn、CD56對纖支鏡活檢標本小細胞癌的陽性率分別為48.4%和100%[9]。本研究選用p63、CK5/6、CK7、TTF-1對細胞學診斷為非小細胞癌的標本進行肺癌分型，選用Syn和CD56對小細胞癌進行鑒別，結果顯示，p63、CK5/6對鱗癌的敏感度，CK7、TTF-1對腺癌的敏感度均較高，Syn和CD56對3例小細胞癌也顯示出良好的敏感性，與文獻報道結果相似[10-11]。同時本研究中ICC對肺癌的分型結果與組織學分型的一致性較高(Kappa值=0.761 6)。提示保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液標本，對細胞抗原的保存較好，可用于ICC檢測，結合相關抗體的表達，可提高細胞學診斷肺癌的水平。

本研究結果還顯示，p63、CK7和TTF-1的敏感性較組織學偏低，可能與下列因素有關：(1)纖支鏡細胞學取材時得到的腫瘤細胞數量較少；(2)脫落的腫瘤細胞其抗原的丟失程度可能較活檢組織多；(3)細胞涂片ICC核抗體需穿透細胞膜才能和核抗原相結合，而組織切片核抗體可直接與核抗原結合。

綜上所述，ICC可以為肺癌分型提供更多的客觀依據，良好的細胞保存和固定既是ICC質量保證的先決條件，又是做出正確診斷的基礎。自配液基保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液細胞標本后行液基制片再進行ICC檢測，其對肺癌的分型結果與組織病理學診斷的一致性較高。與成本較高的商品化液基耗材相比，自配液基保存液費用低，檢測結果穩定，且操作簡便，可進行普及和推廣，但其對細胞抗原保存的效果是否優于商品化液基保存液，還有待研究。