曙紅探針光度法檢測雞肉與雞蛋中殘留恩諾沙星

唐志華，熊海濤，解萌

1(陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西 漢中，723001) 2(陜西理工大學 化學與環境科學學院，陜西 漢中，723001)

恩諾沙星(Enrofloxacin)又稱乙基環丙沙基，是第三代喹諾酮類抗生素。作為一種廣譜類抗菌活性藥物，其對支原體、革蘭氏陽性或陰性菌等有很好的殺滅效果，被廣泛應用于畜牧及水產養殖等領域[1]。但是長期且過度使用會使其殘留在牲畜及水產品中，進而在食用的人體內產生耐藥性或致癌風險[2]。因此，對牲畜及水產品中恩諾沙星含量的準確檢測就顯得非常重要。目前，恩諾沙星的檢測方法主要有高效液相色譜法[3-5]、毛細血管電泳法[6-7]、熒光光度法[8-9]、化學發光分析法/化學發光免疫法[10-13]、酶聯免疫(ELISA)法[14-15]及電化學分析法[16-18]等。這些分析方法存在很多問題，比如，高效液相色譜法與毛細血管電泳法具有較高的準確度，但儀器昂貴，分析靈敏度低；熒光光度法與化學發光法雖然具有較高的靈敏度，但是其需要特殊試劑且方法的選擇性較差；而酶聯免疫法,制備的抗體與多種殘留藥物進行反應，不宜作為單一檢測方法,僅適用于對大量樣品的快速篩選與檢測;電化學分析法通常需對電極界面進行修飾，導致檢測過程費時，且分析的重現性也較差。

探針分光光度法(又稱荷移光度法)主要是基于染料分子與一些特定有機小分子在某種反應介質中相互作用后形成新型離子締合物，致使原有染料分子溶液的紫外-可見吸收光譜及吸光度均發生顯著改變，從而實現對有機小分子進行靈敏檢測。其中曙紅是近些年探針光度法中應用較為廣泛的染料分子之一。如江虹等[19]利用甲砜霉素和曙紅在酸性條件下反應生成的締合物會使體系的吸光度變大，從而建立了一種簡便且快速檢測甲砜霉素的分光光度法，檢出限低至0.095 mg/L。而曾崗等[20]研究發現，在酸性介質中曙紅與鹽酸普羅帕酮能形成1∶1型離子締合物，據此對鹽酸普羅帕酮進行了靈敏檢測。另外，李俊波等[21]利用曙紅與長春瑞濱在強酸性介質下形成1∶2型離子締合物而發生褪色反應，據此建立了一種探針光度法測定長春瑞濱的新方法，線性范圍在0.25～15 μg/mL之間。但到目前為止，利用曙紅探針光度法靈敏測定恩諾沙星的文獻尚無報道。

本文依據在酸性介質中曙紅與少量恩諾沙星相互作用后能形成一種新型離子締合物(使反應體系的吸收光譜發生變化)，據此建立一種準確且靈敏地檢測恩諾沙星的光度分析法。該方法能為肉類食品中恩諾沙星含量地測定提供一種參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平，上海奧斯儀器有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；800型離心機，上海手術機械廠；pHS-3C精密酸度計，上海大普儀器有限公司。

恩諾沙星純品(純度99.7%)，北京索萊寶科技有限公司；NaOH(0.1 mol/L)、曙紅(0.40 mmol/L)及BaCl2，國藥集團化學試劑有限公司；CaCl2、MgCl2及CuSO4，成都市科隆化工試劑廠公司；二氯甲烷、甲醇、葡萄糖、蔗糖及淀粉，天津科密歐化學試劑有限公司；蘇氨酸、甘氨酸及組氨酸，北京萊耀生物科技有限公司；0.1 mol/L鹽酸溶液；0.01 mol/L硫酸溶液；1.0 mol/L醋酸溶液。

恩諾沙星儲備液(1.0 mmol/L)的配制：準確稱取0.359 4 g恩諾沙星純品，先使用3.0 mL NaOH(0.1 mol/L)進行溶解，再用HCl調節至中性，并轉移至100 mL容量瓶中,并定容于100 mL，搖勻待用；使用時用高純水稀釋至所需濃度。

所用試劑均為分析純，實驗用水均為高純水。

雞肉與雞蛋，漢中漢臺區水產批發市場。

1.2 樣品的處理

取洗凈且在研缽中研碎的雞肉5.0 g，加入5.0 g無水Na2SO4繼續研磨均勻。然后，放入10 mL離心管中，加入二氯甲烷4 mL，高速勻漿3 min，再離心6 min，移取上清液。把剩下的殘渣再重新提取1遍，將2次的上清液合并，再用HAc-NaAc(pH 5.0)緩沖液稀釋至10 mL。

將雞蛋攪勻，放在253 K冰箱中保存，取適量放在10 mL離心管中，加入6 mL二氯甲烷提取劑，高速勻漿3 min,離心6 min，操作同上。

1.3 實驗方法

在25 mL比色管中，依次加入適量曙紅及恩諾沙星標準系列溶液(或樣品溶液)，再用一定濃度的鹽酸稀釋至刻度線，搖勻，室溫下放置4 min，以緩沖溶液作為參比溶液，在波長為520 nm處測定體系的吸光度，以吸光度A對恩諾沙星濃度作圖，進而檢測樣品中恩諾沙星含量。

2 結果與分析

2.1 不同體系吸收光譜的研究

按照實驗方法配制不同體系的溶液，以0.01 mol/L HCl為參比溶液,在波長200～750 nm范圍進行光譜掃描(見圖1)。恩諾沙星在271 nm處有一強吸收峰，而在可見光區幾乎沒有吸收；另外，曙紅溶液的最大吸收波長在514 nm處，而同濃度的曙紅溶液與一定濃度的恩諾沙星反應后，體系的最大吸收波長紅移至520 nm處，且吸收強度明顯降低。這說明曙紅與恩諾沙星相混合后，會有新復合物生成。進一步研究發現(圖2)，隨著恩諾沙星濃度依次增大，二者混合體系在520 nm處的吸光值逐漸下降。因此，可以在520 nm波長處對恩諾沙星進行定量分析。

a-1.0×10-5 mol/L曙紅; b-1.0×10-5 mol/L曙紅+5.0 μg/mL恩諾沙星;c-5.0 μg/mL恩諾沙星

圖1 不同體系的吸收光譜圖

Fig.1 Absorption spectra of the different systems

圖2 不同質量濃度的恩諾沙星存在時反應體系的的吸收光譜

Fig.2 Absorption spectra of the selecting system in the presence of different enrofloxacin concentrations

2.2 反應機理探討

已有文獻報道[21-22]，在pH 2.5的酸性介質中，曙紅主要以陰離子(帶2個負電荷)形式存在。而恩諾沙星分子中有3個叔胺(R3N)單元，會在強酸性介質中發生質子化以形成銨鹽(R3NH+)，結果使恩諾沙星分子具有正電荷特性。因此，當一定濃度的曙紅與恩諾沙星溶液相混合后，通過二者之間的靜電與疏水作用生成一種離子締合物。為了進一步探討該離子締合物的組成，本實驗采用了摩爾比法。結果表明，隨著曙紅溶液濃度的增加，吸光值逐漸越大，當二者摩爾比增大到1以后，吸光度不再增加，說明離子締合物已經反應完全，即，曙紅與恩諾沙星形成的締合物組成比為1∶1(圖3)。

圖3 曙紅與恩諾沙星溶液摩爾比對吸光度的影響

Fig.3 Effect of the molar ratio of eosin to enrofloacxin on the absorbance

2.3 實驗條件選擇

2.3.1 反應介質pH值的選擇

固定曙紅與恩諾沙星溶液濃度不變，考察了不同pH反應介質中體系的吸光度。從圖4可以看出，隨著pH值的增大，吸光度呈現先增大后減小的趨勢，當反應介質的pH值控制在2.7附近時，體系的吸光度最大。這可能是由于在強酸性介質中曙紅與恩諾沙星均容易發生質子化，而在較高的pH值反應介質中，恩諾沙星的質子化程度變弱，即反應介質的pH值過低或過高時均會使曙紅與恩諾沙星締合的趨勢變弱。因此，實驗選擇反應介質的最佳pH值為2.7。

圖4 pH值對吸光度的影響

Fig.4 Effect of pH value on the absorbance

2.3.2 曙紅濃度的選擇

固定最適pH值不變，恩諾沙星質量濃度為0.5 μg/mL，本實驗測定了曙紅濃度在0.5×10-5～1.0×10-4mol/L范圍內體系的吸光度(如圖5所示)。結果表明，隨著曙紅濃度的增大，體系吸光度逐漸增大，但當曙紅濃度超過2.5×10-5mol/L后，體系吸光度則會逐漸下降。這可能是由于作為體系的探針——曙紅，其較低的濃度不利于體系完全反應，而過高的濃度則會引起體系自吸收程度增強。所以，曙紅的最適濃度為2.5×10-5mol/L。

圖5 曙紅溶液濃度對吸光度的影響

Fig.5 Effect of eosin concentration on the absorbance

2.3.3 反應時間的選擇

保持曙紅濃度、pH值及恩諾沙星濃度不變，對體系反應時間分別在2、4、8、10及15 min時的吸光度進行測定。從圖6可以看出，剛開始隨著反應時間的延長，體系吸光度逐漸增大，超過4 min后，體系吸光度無明顯變化。這說明在選定的實驗條件下，曙紅與恩諾沙星能在4 min內反應完全。因此，實驗選擇最佳反應時間為4 min。

圖6 反應時間對吸光度的影響

Fig.6 Effect of reaction time on the absorbance

2.3.4 反應溫度的選擇

在其他條件不變的情況下，實驗考察了不同反應溫度對反應體系吸光度的影響。圖7顯示，在20～80 ℃范圍內，隨著反應溫度的升高，體系的吸光度逐漸下降。這可能是由于隨著反應溫度的增大，曙紅與恩諾沙星相結合而生成離子締合物的穩定性減弱所致。故實驗選擇在近室溫(20 ℃)條件下進行研究。

圖7 反應溫度對吸光的影響

Fig.7 Effect of reaction temperature on the absorbance

2.4 標準曲線

在優化的實驗條件下，恩諾沙星濃度分別在0.08～2.0 μg/mL與2.0～10.0 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系，其線性回歸方程分別為A=0.150 9C+1.245 8，A=0.008 9C+1.520 8；相關系數分別為0.996 2和0.996 9。按IUPAC建議，估算得方法檢出限為0.05 μg/mL。對濃度為1.0 μg/mL恩諾沙星進行8次平行測定，其相對標準偏差(RSD)不大于5%。

2.5 共存物的影響結果

2.6 樣品分析

各取1.2樣品處理液1.0 mL，按照1.3實驗方法對雞肉與雞蛋中恩諾沙星含量進行測定，并做加標回收實驗。從表1與表2可見,雞肉與雞蛋中恩諾沙星的含量分別為1.06 μg/mL和0.36 μg/mL，而平均回收率則分別為93.61%和92.17%，相對標準偏差(RSD)均不大于5.1%。這說明建立的方法具有較高的準確度和精密度。

表1 雞肉中恩諾沙星含量分析及回收率實驗結果(n=3)

表2 雞蛋中恩諾沙星含量分析及回收率實驗(n=3)

3 結論

本實驗利用酸性介質中恩諾沙星與曙紅能形成一種離子締合物而使曙紅的吸收波長發生紅移，且隨著恩諾沙星濃度增大吸光度逐漸減小，由此建立了一種測定恩諾沙星含量的新方法。該方法具有操作簡便、快速、試劑廉價、準確且靈敏度較高等特點，有望作為一種恩諾沙星殘留的快速檢測方法而應用于食品安全監管領域。