紙層析-酶標儀法測定發酵液中γ-氨基丁酸

張敏，薛正蓮，余飛，劉艷，王洲

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖,241000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種天然非蛋白質類氨基酸，具有降血糖、降血壓及抗抑郁等重要的生理功能，作為功能性食品在市場上具有較廣的前景[1-4]。其主要是由谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)催化L-谷氨酸形成。GABA的測定方法有很多種，比如柱前衍生化高效液相色譜法[5-7]、核磁共振波譜技術[8]、氣質聯用法[9]、毛細管電泳法[10-11]、分光光度法[12-14]、氨基酸分析儀測定法[15]等。但以上方法大部分儀器昂貴、耗時較長、過程繁瑣，不適合實驗室大批量定性定量檢測GABA。

紙層析能夠快速定性檢出各種氨基酸物質，其中GABA常用的定性方法就是通過紙層析法直觀檢測出來，采用洗脫手段將薄層色譜上的目標氨基酸斑點洗脫下來，結合分光光度計在一定波長下檢測出對應濃度的吸光度[16-17]。紙層析-分光光度法既能定性又能定量檢測出氨基酸，且檢測出的GABA是純物質，消除了發酵液中其他物質的干擾，大大提高了試驗的準確性與高效性，為后續提純GABA試驗過程奠定了基礎[18]。但分光光度計檢測過程相對繁瑣，耗時較長，1次能檢測的樣品數有限，降低了試驗速度與效率。酶標儀檢測原理與分光光度計一樣，但酶標儀能夠同時檢測多個樣品，檢測時間少，所需樣液少，節約了大量試劑，并在一定程度上保護了環境。

目前關于紙層析-酶標儀法測定微孔板發酵液中GABA產量的方法還未見文獻報道，因此本研究建立紙層析-酶標儀法，并對影響此方法的重要因素進行優化，為后續高通量選育GABA高產菌株奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GABA為標準品；CuSO4·5H2O、無水乙醇、正丁醇、冰醋酸，均為分析純；茚三酮為BP級；以上試劑均購于生工生物；水為超純水。

層析液：V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=5∶3∶2，加入12 g/L的茚三酮[19]。

洗脫液：質量分數為75%乙醇∶6 g/L CuSO4·5H2O(體積比)為38∶2[19]。

全波長酶標儀，Thermo；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析；振蕩水浴鍋，天瑞儀器。

1.2 菌株

糞腸乳酸球菌(L-120-1)由本實驗室保藏。

1.3 培養基

種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖5，吐溫-80 0.1 mL，K2HPO40.2，檸檬酸二銨0.2，MgSO40.2，MnSO40.05，CH3COONa·3H2O 5；115 ℃滅菌30 min，1 mL/96孔板，100 mL/250 mL搖瓶，100 r/min培養16 h。

發酵培養基(g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸出粉5，葡萄糖10，丁二酸鈉5，L-谷氨酸 10；115 ℃滅菌30 min，1 mL/96孔板，75 mL/250 mL搖瓶，靜置培養3 d。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測波長的選擇

將新華一號濾紙裁剪成所需大小，濾紙下端2 cm處輕輕畫1條直線，在線上每隔2 cm畫1個小圓圈，圈直徑不超過3 mm，用微量取樣器吸取質量濃度為5.5 g/L標準樣液1 μL點在小圓圈內，點樣點干后，將層析紙卷成桶狀固定住并垂直放進已被層析液飽和12 h的層析缸內，密閉層析一定時間，后取出濾紙，并用烘干槍吹干，待出現紫色斑點且斑點大小及形狀不變時，將斑點剪下并放入5 mL洗脫液中，洗脫條件：40 ℃，80 r/min，水浴洗脫30 min。使用酶標儀在200～900 nm進行全波長掃描，確定GABA的最大吸收峰。

1.4.2 GABA測定原理及方法

測定原理：GABA在紙層析過程中會與茚三酮反應且經過高溫顯色生成紫紅色斑點，乙醇能夠洗脫下斑點并與銅離子結合，生成紅色離子締合物，在一定的波長下有最大吸收峰，可以測定發酵液中的GABA產量[19]。

紙層析-分光光度法：按照參考文獻[13]測定發酵液中GABA產量。

紙層析-酶標儀法：取1 mL的發酵液于6 000 r/min離心5 min，后取上清液在沸水中煮5 min，用微量取樣器吸取1 μL按1.4.1同樣方式處理，使用酶標儀測定吸光度。

1.4.3 測定方法中主要影響因素的優化

分別配制質量濃度為1、5、10 g/L的GABA標準溶液，按照1.4.2的測定方法對主要影響因素即層析液中顯色劑-茚三酮的濃度、展開劑-正丁醇與冰醋酸與水三者體積比、洗脫液中乙醇的體積分數，乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O體積比進行優化。其中對顯色劑-茚三酮濃度進行優化時，茚三酮濃度值分別為4、8、12、16 g/L；展開劑-正丁醇∶冰醋酸∶水配比優化時設為(體積比)5∶3∶2、5∶2∶3、5∶1∶4、2∶1∶1、3∶2∶1、3∶1∶2、2∶3∶1；對洗脫液中乙醇的體積分數進行優化時，乙醇的體積分數值設為0、25%、50%、75%、100%；洗脫液中乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O配比優化時設為(體積比)39∶1、38∶2、37∶3、36∶4。

1.4.4 標準曲線的建立

精確配制10 g/L的GABA標準液，分別稀釋成1、2、3、4、5、6、7 g/L，按優化后的方法分別使用酶標儀與分光光度計測定吸光度，建立標準曲線1、2。

1.4.5 穩定性試驗

用微量取樣器吸取5 g/L GABA標準樣液1 μL按優化后的方法進行處理后放入5 mL洗脫液中，分別洗脫10、20、30、60、90 min，使用酶標儀測定吸光度。

1.4.6 精密度試驗

將質量濃度分別為1.5 g/L和6.5 g/L的GABA標準品分別加入到已知質量濃度的發酵液中，按照優化后的方法測定吸光度，計算標準品濃度，每組樣品設置3個重復。

1.4.7 加標回收率試驗

將質量濃度分別為2、3、4、5、6 g/L的GABA標準品分別加入到已知質量濃度的發酵液中，按照優化后的方法測定吸光度，計算標準品濃度及回收率，每組樣品設置3個重復。

1.4.8 兩種方法擬合驗證

將經過ARTP誘變后所獲得的30株突變株進行96孔板發酵，分別使用優化后的紙層析-酶標儀法和紙層析-分光光度法同時測定發酵液中GABA產量，并利用origin 9.1軟件進行曲線擬合。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

如圖1所示，GABA經過一系列反應生成的紅色離子締合物在512 nm處有最大吸收峰，故接下來的試驗采用512 nm為檢測波長。

圖1 γ-氨基丁酸紫外可見吸收光譜

Fig.1 UV absorption spectra of GABA

2.2 測定方法中主要影響因素的優化

分別對紙層析-酶標儀法的主要影響因素即層析液中顯色劑-茚三酮的濃度、展開劑-正丁醇與冰醋酸與水3者體積比、洗脫液中乙醇的體積分數，乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O體積比進行優化，結果如下：

2.2.1 層析液中茚三酮濃度對吸光度的影響

按1.4.2測定方法所測得的結果如圖2。如圖2所示，利用3種質量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進行試驗，均出現隨著層析液中茚三酮濃度的逐漸增加，GABA反應生成的紅色離子締合物吸光度先增加后減少，且在茚三酮質量濃度達到8 g/L時，反應體系的吸光度達到最大的現象。此種現象出現的原因可能是當茚三酮質量濃度為8 g/L時，GABA與茚三酮能夠更好地結合且反應靈敏，經過高溫顯色后生成紫紅色斑點效果最好，因此后續試驗以8 g/L的茚三酮為顯色劑。

圖2 層析液中茚三酮質量濃度對吸光度的影響

Fig.2 Effect of concentration of ninhydrin in chromatography solution on absorbance

2.2.2 層析液中展開劑配比對吸光度的影響

不同展開劑配比層析效果如表1。L-谷氨酸為生成GABA所需的底物，因此在發酵培養基中添加一定質量濃度的L-谷氨酸，有利于GABA的生物合成[20]。但是發酵液中L-谷氨酸并未消耗完，且L-谷氨酸與GABA的極性相近，在紙層析時2者不易分開，為發酵液中產物GABA的分離帶來困擾，本試驗在GABA標準品溶液中添加了5 g/L的L-谷氨酸，以獲得能夠排除這種干擾因素的展開劑配比。層析的效果如表1所示，GABA及L-谷氨酸在不同層析液中，上行速度不同，若層析液中流動相冰醋酸占比越大，GABA與L-谷氨酸上行速度越快，2者分不開或者L-谷氨酸嚴重拖尾，導致與GABA重疊部分較多，影響最終測定結果，使發酵液中GABA理論值偏高。若層析液中固定相水占比越大，GABA與L-谷氨酸層析速度則越慢，可能會導致樣品丟失。因此選用合適配比的展開劑對試驗至關重要，如表1所示，層析效果最好的是展開劑配比為2∶1∶1與3∶1∶2。但遷移率差值有時也可為層析效果提供參考，通常遷移率差值越大，層析效果越好[21]。由于配比為2∶1∶1展開劑中GABA與L-谷氨酸遷移率差值大于3∶1∶2，因此后續試驗選擇展開劑配比為V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=2∶1∶1。

表1 不同配比的展開劑層析效果

注：展開劑配比為V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)。

2.2.3 洗脫液中乙醇的體積分數對吸光度的影響

按1.4.2測定方法所測得的結果如圖3。

圖3 洗脫液中乙醇體積分數對吸光度的影響

Fig.3 Effect of the volume fraction of ethanol of eluent on absorbance

如圖3所示，利用3種質量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進行試驗，均出現隨著洗脫液中乙醇體積分數的逐漸增加，GABA反應生成的紅色離子締合物吸光度先增加后減少，且在乙醇體積分數達到75%時，反應體系的吸光度達到最大值。這可能是由于當乙醇體積分數分別為25%與50%時，洗脫液不能徹底洗脫下濾紙上的斑點，導致所測得的吸光值偏低且沒有可靠性；而當乙醇體積分數為100%時，吸光度也偏小的原因可能是GABA與茚三酮高溫顯色反應生成的物質進一步與Cu2+結合需要在一定含量的水存在下進行。因此，后續研究洗脫液中乙醇的體積分數采用75%。

2.2.4 洗脫液配比對吸光度的影響

按1.4.2測定方法所測得的結果如圖4。

圖4 洗脫液配比對吸光度的影響

Fig.4 Effect of eluent ratio on absorbance

如圖4所示，利用3種質量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進行試驗，當洗脫液中75%乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O的體積比為39∶1時，GABA反應生成的紅色離子締合物吸光度達到最大，后繼續提高Cu2+濃度，吸光度卻逐漸減小。這種現象出現的原因可能與CuSO4的Cu2+與茚三酮-GABA結合物的締合程度有關，Cu2+濃度越大，最終反應體系的吸光值越小，因此后續試驗選擇75%乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O配比為39∶1的洗脫液作為最適洗脫溶液。

2.3 標準曲線的建立

如圖5所示，酶標儀與分光光度計測定的GABA標準品濃度在1～7 g/L之間均有較好的線性關系。其中酶標儀所建線性方程為：y1=0.018 9x+0.009 1(R2=0.999 0)，可以利用酶標儀-紙層析法快速檢測發酵液中GABA的含量。

圖5 酶標儀與分光光度計建立標準曲線

Fig.5 The standard curve was established by microplate reader and spectrophotometer

2.4 穩定性試驗

從表2可知，洗脫液對GABA高溫顯色形成的紫紅色斑點進行洗脫，反應10～30 min，紅色離子締合物的形成并未達到飽和，吸光度偏小；反應30 min后，紅色離子締合物幾乎達到飽和，吸光度達到最大值。在實際過程中，檢測誘變后大量突變株經孔板發酵后效價需要一定的操作時間，而從表2可知，GABA反應液在30～90 min內吸光度基本保持不變，穩定性良好，滿足實際需求。

表2 GABA反應液的穩定性試驗結果

2.5 精密度試驗

為了盡可能減少試驗誤差，使得試驗更準確，必須在工業檢測中提高試驗精密度[22]。由表3可知，各組在低濃度和高濃度的RSD均小于0.5%，表明該方法測定發酵液中GABA含量精密度高。

表3 精密度試驗

2.6 加標回收率試驗

為了驗證樣品的前處理過程是否對樣品的測定產生影響以及測量過程中是否有基體干擾，必須進行加標回收試驗[23]。從表4可知，平均回收率為98.248 5%，RSD為2.625 5%。結果表明，采用酶標儀-紙層析法測定發酵液中GABA加樣回收率較高，前處理過程及水溶液基體對樣品的測定影響幾乎可以忽略不計。

表4 加標回收率

2.7 兩種方法擬合結果

相關強度由相關系數的絕對值決定，相關系數的正負是相關方向，根據經驗，統計學家提出了相關性強度的判斷標準，將R2=0.7作為一個較高的相關關系[24]。由圖7可知，擬合曲線的R2=0.939 8，表明紙層析-酶標儀法與紙層析-分光光度法同時測定誘變后大量突變株發酵液中的GABA含量具有很好的正相關性，可以利用紙層析-酶標儀法快速、高效地測定較多發酵樣品中GABA的含量。

a-標峰紙層析；b-發酵液紙層析

圖6 標樣與發酵液紙層析圖

Fig.6 Result of GABA paper chromatogram

注：圖6為部分突變株(編號為5、6、7，每組發酵液樣品設置3個重復)發酵液中GABA的紙層析圖，可以直觀地看出GABA斑點的分布以及濃度相對大小。

圖7 紙層析-酶標儀法與紙層析-分光光度法測定發酵液中GABA的相關性

Fig.7 The relationship between paper chromatography-microplate reader and paper chromatography-spectrophotometer for determination of GABA in fermentation broth

3 討論

目前文獻報道中關于GABA的測定方法主要包括：(1)高效液相色譜法：廣泛用于植物如桑葉、糙米、豆豉等中GABA含量的測定，該方法靈敏度高、穩定性好、測定結果準確、使用范圍廣，但耗時較長，比較昂貴，適合科研中有高準確度要求的測定使用；(2)氨基酸分析儀測定法：在靈敏度及多樣品處理時表現較好，可用于GABA產生菌菌種選育，但是使用這種測定方法成本昂貴，測定耗時長，故在工業生產中使用較少；(3)分光光度法：在GABA產量的測定中，簡單、準確，但效率較低。酶標儀滿足吸光物質濃度在一定波長下與吸光度成線性相關的規律，是實驗室常用的設備[25-26]，適用于物質的檢測定量分析，且能夠一次性快速檢測大量的樣品，在GABA高產菌株的選育中具有高效性。

本研究對影響紙層析-酶標儀法的主要因素進行優化，并利用此方法與紙層析-分光光度法同時測定誘變后多批突變株發酵液中GABA產量且進行了曲線擬合，結果表明2種方法測定GABA含量線性關系良好，紙層析-酶標儀法能快速、準確地測定微孔板發酵液中GABA產量，為后續高通量選育GABA高產菌株奠定了基礎。