紫外-常壓室溫等離子體復合誘變高產纖維素酶真菌

李豪，白光劍，吳靜，楊海泉，鄒偉*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

纖維素是目前世界上含量最豐富的天然可再生資源，纖維素資源的高效開發利用是當前研究熱點[1-2]。微生物處理纖維素是1種高效、綠色環保的方法，主要利用微生物產生纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖，然后再通過發酵轉化為其他有價值的化合物，比如乙醇和單細胞蛋白等[3]。纖維素酶由多種復合酶系組成，主要包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3種酶協同作用于纖維素物質并將其降解[4-5]。它廣泛存在于微生物、原生動物和植物中，目前發現具有纖維素降解功能的微生物菌屬很多，如木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[6-7]。國內外對降解纖維素菌株研究多集中在真菌，因為真菌產纖維素酶系較全，分解纖維素能力較強[8]。纖維素酶在飼料、紡織、食品、醫藥等領域有良好的市場前景[9]。

目前由于纖維素酶產量低、成本高等問題，導致纖維素酶的工業應用受到限制。高酶活菌株的選育仍然是重要的研究方向，國內外許多學者做了相關研究，如曾思泉等[10]從紅樹林根際土壤中獲得1株產纖維素酶的枝孢屬菌(Cladosporiumsp.)，SWAIN等[11]從牛糞中篩選得到5株具有較高纖維素酶活力的枯草芽孢桿菌等。但自然篩選獲得的菌株產酶能力有限，通過誘變提高產酶能力是常見的方法，比如常用的紫外誘變能使相鄰的嘧啶形成二聚體，導致菌株遺傳物質發生改變從而提高酶活[12-13]。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變技術是近年來發展的1種新型誘變技術，在高純度的氦氣作為出發氣體的條件下，大量非平衡性等離子體流作用于微生物的遺傳物質，破壞單核苷酸的磷酸二酯鍵，誘發細胞SOS修復機制，從而導致遺傳物質突變[14]。周羅娜等[15]利用ARTP誘變黑曲霉提高產單寧酶的能力，其酶活提高2倍。SANGWIJIT等[16]利用ARTP誘變解淀粉芽孢桿菌提高其產纖維素酶能力。ARTP誘變方法具有突變率高、遺傳穩定性強，操作簡單、安全的優點，因此受到越來越多的關注和應用[17]。

本研究以實驗室前期篩選獲得的高產纖維酶枝孢菌B03作為出發菌株[2]，通過紫外誘變和ARTP誘變，用剛果紅染色進行初篩，酶活作為復篩，獲得產酶能力提高、遺傳穩定的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枝孢菌(Cladosporium)B03，本實驗室選育保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10，蛋白胨3，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.3。

CMC培養基(g/L)：CMC-Na 10，(NH4)2SO44，蛋白胨1，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，瓊脂20。

液體產酶培養基(g/L)：CMC-Na 10，蛋白胨3，酵母膏0.2，(NH4)2SO42，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.3。

1.1.3 試驗試劑

檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)、0.9%生理鹽水、3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液、剛果紅溶液(1 mg/mL)、CMC-Na、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、(NH4)2SO4、甘油、脫脂棉等(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 儀器與設備

ARTP-Ⅱ型誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；MJ-250恒溫培養箱、TG-16醫用離心機，四川蜀科儀器有限公司；Phs-3C酸度計、YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F凈化工作臺、HH-6D數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造；V-1000可見分光光度計，翱藝儀器有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩器，上海蘇坤實業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及發酵培養

菌株活化：將-4 ℃斜面保存的菌株取出，在CMC培養基上連續3～4次劃線培養(28 ℃)，然后將菌株斜面培養，制備孢子懸浮液?；罨蟮木暌匝篮?點法點種在CMC培養基中，28 ℃培養3 d后用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，測定菌落直徑與透明圈直徑，計算透明圈與菌落的直徑比[18]。

發酵液培養：將活化后的菌株接種于種子培養液中，在28 ℃、180 r/min條件下培養36 h，然后按5%的接種量接種于液體產酶培養基中，28 ℃、180 r/min條件下培養3 d，將發酵液過濾，濾液6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。測定菌株羥甲基纖維素(CMC)酶活和濾紙(FPA)酶活。

CMC酶活測定：4根25 mL比色管，1根作空白對照，4根管中都加入1.5 mL濃度為1%的CMC溶液，3根實驗管中加入0.5 mL粗酶液，空白管不加粗酶液，在50 ℃下反應30 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后迅速與實驗管一起放入沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測定吸光值，計算酶活。

FPA酶活測定：4根25 mL比色管，1根作空白對照，4根管中都加入折成M形的質量為50 mg的濾紙(長6 cm，寬1 cm)，然后加入1.5 mL pH 4.8的磷酸緩沖液，3根實驗管中再加入0.5 mL粗酶液，空白管不加酶液，50 ℃下反應60 min，取出后都加入1.5 mL DNS溶液，空白管加入0.5 mL粗酶液后與實驗管迅速放入沸水浴10 min，冷卻至室溫后定容到25 mL，540 nm下測定吸光值，計算酶活。

酶活定義：在一定條件下，1 mL粗酶液1 min水解底物產生1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個酶活單位U。

1.2.2 菌株紫外誘變選育

孢子懸浮液：將斜面培養好的菌株用滅菌的生理鹽水沖洗孢子，在28 ℃、180 r/min條件下活化3 h后用滅菌的脫脂棉過濾孢子溶液，然后用血細胞計數板計數，使孢子濃度在106～108CFU/mL范圍內。

將配制好的孢子懸浮液裝入滅菌的空平板內，置于超凈工作臺上，黑暗條件下使用20 W紫外燈在30 cm處分別照射0、1、2、4、6、8、10和13 min，分別取不同照射時間的孢子液稀釋適合倍數，取200 μL涂布于CMC平板，在28 ℃下暗培養，計數并計算致死率。

紫外誘變及篩選：選擇致死率在90%左右的時間進行誘變育種。將誘變處理后的孢子液涂布于CMC培養基中，28 ℃暗培養后把單菌落分別挑出編號進行劃線培養，純培養后將菌株以3點法點種于CMC培養基中，28 ℃培養3 d后用1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，測定菌落直徑與透明圈直徑，篩選出直徑比大的菌株進行CMC酶活和FPA酶活測定復篩。篩選出酶活能力提高的菌株進行ARTP誘變選育。

1.2.3 ARTP誘變選育

孢子懸浮液：將經過紫外處理酶活提高的菌株在28 ℃條件下進行斜面培養，用滅菌的生理鹽水將孢子洗下，洗滌前可用接種環適當刮下孢子，然后再28 ℃、180 r/min條件下活化3 h后用滅菌的脫脂棉過濾孢子溶液，并用血細胞計數板計數，使孢子濃度在106～108范圍內。將調節好濃度的孢子液在8 000 r/min的條件下離心5 min，棄上清液，加入1 mL 2%甘油溶液并振蕩均勻作為孢子懸浮液。

在高純的氦氣作為ARTP的工作氣源，電源功率100 W，氣體流量10 SLM，照射距離2 mm的條件下，對8個載片上10 μL孢子液進行誘變處理，處理時間依次為0、20、60、80、100、120、150、180和210 s[19]。處理后稀釋相應倍數涂布于CMC平板上，28 ℃培養至出現單菌落，計數并計算致死率。選取致死率在90%左右時作為誘變處理時間。篩選方法同紫外誘變，得到酶活提高的菌株。

1.2.4 突變菌株遺傳穩定性檢測

將篩選得到的突變菌株連續傳代培養，檢測1、2、3、4、5和6代菌株發酵液中CMC酶活、FPA酶活，以確定突變菌株的遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 菌株B03的活化、透明圈及酶活測定

將菌種B03從斜面保存連續劃線純培養3～4代，測定菌株的透明圈與菌落直徑比為2.53?；罨蟮木杲臃N到種子培養基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養36 h，5%的接種量接種到液體產酶培養基中，相同條件下培養3 d，測定菌株CMC酶活為(427.62±2.78)U/mL，FPA酶活為(46.83±1.85) U/mL。以該菌株作為誘變的出發菌株。

2.2 紫外誘變選育

由圖1可知，隨著照射時間的增長，菌株的致死率也增大，一般選擇致死率為90%左右作為誘變處理量。當照射時間為8 min時，菌株致死率為91.67%，因此選擇8 min作為紫外誘變照射時間。

圖1 菌株B03紫外誘變致死曲線

Fig.1 Lethal rate curve of strain B03 by UV mutagenesis

以菌株B03作為出發菌株，經過紫外處理8 min后涂布于CMC培養基上，黑暗條件下28 ℃培養3 d，將單菌落分別挑出編號，共計菌株63株，編號為UV-01～UV-63，對篩選出的63株菌株測定其透明圈與菌落比值，將比值較大菌株進行酶活測定，結果如表1所示。(由于透明圈在測定時與菌株生長狀態有關，菌落較小可能比值較大，但菌落較小可能說明菌株生長緩慢，因此透明圈與菌落比值大小應選擇相對較大值的菌株進行酶活測定)。將菌株透明圈較大的10株菌測定其酶活，發現菌株UV-10、UV-42的FPA酶活有所提高，其中UV-42相對B03的FPA酶活提高17.85%，菌株UV-03、UV-29的CMC酶活有所提高，UV-03較原菌株CMC酶活提高18.79%(表2)。因為FPA酶活測定底物為濾紙，濾紙較難分解，所以酶活較低，而出發菌株具有較高的CMC酶活，因此以CMC酶活作為主要篩選指標，將菌株UV-03作為ARTP誘變的出發菌株進行誘導。

表1 紫外誘變后的初篩結果

表2 紫外誘變后酶活力 單位：U/mL

2.3 ARTP誘變選育

對菌株UV-03進行ARTP誘變操作，測定ARTP致死曲線，結果顯示ARTP處理時間越長，致死率越大(圖2)。菌株在20 s時致死率將近60%，可能因為開始菌株對ARTP較為敏感所致。在處理120 s時，致死率為90.85%，超過120 s后致死率接近100%，因此選擇120 s作為ARTP誘變的處理時間。

圖2 菌株UV-03 ARTP致死曲線

Fig.2 Lethal rate curve of strain UV-03 by ARTP

將菌株UV-03在ARTP儀上誘變處理120 s，稀釋涂布于CMC平板上，28 ℃培養3～4 d后將單菌落挑出繼續劃線純化培養，最終共培養誘變后菌株81株(圖3)。測定經ARTP誘變處理后的81株菌株的透明圈與菌落直徑比，測定比值較大的部分菌株的酶活，結果如表3所示。菌株AY-42、AY-70的FPA酶活分別為(92.27±0.23)、(93.58±3.02) U/mL，較原B03的FPA酶活提高97%左右，并且AY-42的CMC酶活達(582.14±2.32) U/mL，較B03提高36.14%。

圖3 菌株AY-42剛果紅染色

Fig.3 Transparent hydrolysis circle by Congo red staining of strain AY-42

2.4 突變菌株的遺傳穩定性

對突變菌株AY-42進行遺傳穩定性試驗，結果如圖4所示。經過6代連續劃線培養并測定每1代的酶活力，突變菌株AY-42具有較好的穩定性。能夠穩定高效地產纖維素酶。

表3 菌株UV-03 ARTP誘變結果

圖4 突變菌株AY-42產纖維素酶的遺傳穩定性

Fig.4 Cellulase production genetic stability of the strain AY-42

3 結論與討論

目前生物質資源在向能源轉化的過程中仍存在不少技術難題和成本制約，纖維素酶價格過高是其中之一，篩選高產纖維素酶菌株并提高其產酶能力具有重要研究意義[20]。前期此類研究主要通過自然篩選、誘變育種、基因工程等方法對產纖維素酶菌株進行改造，以達到提高菌株產酶能力的目的[21]。如IKE等[22]對里氏木霉進行紫外誘變，篩選后獲得2株產纖維素酶能力分別提高1.1和1.2倍的突變菌株。郭建強等[23]使用紫外-亞硝基胍復合誘變芽孢桿菌使纖維素酶活力提高3.23倍。DINA等[24]使用紫外和化學試劑復合誘變使米曲霉濾紙酶活提高4倍多。誘變育種能使菌株產酶能力提高，目前使用ARTP技術提高真菌產纖維素酶能力報道較少。

本研究以實驗室前期篩選獲得的高產纖維素酶菌株枝孢菌(Cladosporium)B03為出發菌株，經過紫外和ARTP復合誘變，采用透明圈法初篩、酶活復篩的方法篩選出產酶能力提高的菌株AY-42，經遺傳穩定性試驗，該菌株具有高產纖維素酶的穩定性。突變菌株AY-42最終CMC酶活為(582.14±2.32)U/mL，FPA酶活為(92.27±0.23) U/mL，與原始菌株B03相比CMC酶活提高36.14%，FPA酶活提高97.03%，其CMC酶活顯著高于陳麗燕等[25]報道的菌株。在菌株初篩時主要依據透明圈與菌落直徑比值大小，比值大小與菌株生長狀態有很大關聯，在點種后培養過程中菌株生長不規則會導致數據不準，總體上直徑比能夠在菌株數量較多時快速地篩選出產酶能力可能提高的菌株，減少了工作量，提高了篩選效率。同時本實驗采用的ARTP也表現出良好的誘變效果，等離子體能夠破壞核苷酸的磷酸二酯鍵，使細胞啟動SOS修復機制[14]，對微生物的遺傳物質產生強烈的畸變作用，進而誘發菌株產生遺傳穩定的突變。總之，菌株AY-42具有較高的應用價值，可用于后期生物質資源開發。