望江南種子SU5抗菌蛋白的純化、抑菌機(jī)制及穩(wěn)定性研究

袁素素，張瑋瑋，王財成，葉秀娟

(福建農(nóng)林大學(xué),福建 福州 350002)

蘋果黑腐皮殼菌(Valsamali)屬于子囊菌亞門黑腐皮殼屬，能引起蘋果樹的樹干皮層腐爛，導(dǎo)致蘋果樹腐爛病[1]。蘋果樹腐爛病又被稱為蘋果樹癌癥，是一種毀滅性病害，嚴(yán)重影響蘋果的產(chǎn)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病首次在遼寧省南部區(qū)域被發(fā)現(xiàn)[3]，之后蔓延至我國各個蘋果種植區(qū)。我國北部地區(qū)該病害發(fā)生尤為嚴(yán)重，致使蘋果樹樹體布滿傷痕，枝干殘缺，生長較弱，甚至造成整個種植園的蘋果樹枯死絕收。但是由于缺乏對蘋果樹腐爛病流行周期和發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，無法對該病害進(jìn)行有效根本的防治[4]。

望江南，別稱野扁豆、金角子或槐豆等，學(xué)名為CassiaoccidentalisL.，屬1年或多年生豆科決明屬植物。在印度，望江南常被用作草藥來治療各種疾病。研究表明，望江南具有抑菌、殺蟲、抗癌、抗炎癥活性，并能改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[5-11]。望江南種子含有的大黃素甲醚吡喃葡糖苷、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃酸、β-谷甾醇和胡蘿卜苷等7種化合物均對HepG2肝癌細(xì)胞有一定的抑制活性[10]。分離自望江南的倍半萜2,7-二羥基-4-異丙基-6-甲基萘-1-甲醛和降倍半萜3-異丙基-1,6-二甲氧基-5-甲基萘-7-醇均對癌細(xì)胞具有抑制活性[12]。望江南全草甲醇提取物中新蒽醌苷類化合物Emodin-6-O-β-rutinoside和環(huán)阿爾屯烷型三萜Cycloccidentaliside C、Cycloccidentalic acid C對人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)具有較高的抑制活性[13]。此外，從望江南種子中純化得到分子質(zhì)量約為14 ku的殺蟲活性蛋白proteinaceous，其也能抑制銅綠假單胞菌和大腸桿菌[7]。然而對望江南種子中抗真菌蛋白及其抗真菌活性的研究卻顯不足。

本研究選取望江南種子為材料，采用SP-Sepharose陽離子交換層析、Mone S陽離子交換層析和Superdex 75凝膠層析對望江南種子中的抗菌蛋白進(jìn)行純化，并通過紙片擴(kuò)散法、熒光染色法等對此抗菌蛋白的抑菌活性、抑菌機(jī)制和穩(wěn)定性展開研究，以開拓其在蘋果黑腐皮殼菌防治中的應(yīng)用空間，為新型農(nóng)藥的開發(fā)提供新的思路和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

望江南種子：購買于江蘇省新泰種業(yè)批發(fā)有限責(zé)任公司。

植物病原真菌：玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、長丙鏈格孢菌(Alternarialongipes)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolanif)、凸臍蠕孢菌(Exserohilummonoceras)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、小白菜炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)、煙草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、芭樂炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等12種，均由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與生物化學(xué)教育部重點實驗室提供。

主要試劑與儀器：SP-Sepharose陽離子交換層析柱、Mone S陽離子交換層析柱和Superdex 75凝膠層析柱(美國GE公司)；透析袋(分子截留質(zhì)量3.5 ku，美國光譜醫(yī)學(xué)公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料(美國Bio-Rad公司)；熒光綠染料(Sytox green，美國Cambrex公司)；剛果紅染料(上海迪柏化學(xué)品技術(shù)公司)；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。AKTA purifier蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(美國GE公司)；LCJ-18S冷凍干燥機(jī)(上海松源華興科技發(fā)展有限公司)；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；SPH-200F恒溫培養(yǎng)搖床(上海世平實驗儀器有限公司)；Nikon A1激光共聚焦電子顯微鏡(日本Nikon公司)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL；0.7% PDA培養(yǎng)基中，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂7 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基中，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 SU5抗菌蛋白純化

1.2.1 硫酸銨沉淀 將150 g種子清洗干凈，加入20 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6) 1 L后，用豆?jié){機(jī)打碎勻漿，4 ℃條件下浸提12 h，然后在10 000 r/min條件下離心30 min，取上清液備用。種子沉淀中再次加入800 mL緩沖液，4 ℃條件下浸提2.5 h，離心收集2次浸提液。在浸提液中加入硫酸銨使飽和度為50%，4 ℃條件下靜置4 h后，10 000 r/min離心20 min，取上清液在其中加入硫酸銨使飽和度為100%，4 ℃條件下靜置4 h后，10 000 r/min離心20 min，取硫酸銨飽和度為50%～100%時的沉淀蛋白組分。

1.2.2 柱層析純化 將硫酸銨沉淀蛋白組分溶解在20 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6)中，上樣于SP-Sepharose陽離子交換層析柱后，繼續(xù)用緩沖液洗脫不吸附蛋白，至280 nm吸光值(OD280)為0，得到不吸附蛋白組分，然后換用含有0.2、0.5、1 mol/L NaCl的緩沖液對吸附蛋白依次洗脫。最后以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法檢測各蛋白質(zhì)組分的抑菌活性，收集活性蛋白組分，透析并冷凍干燥。

將抑菌活性蛋白組分溶解在10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6)中，上樣于Mone S陽離子交換層析柱后，繼續(xù)用緩沖液洗脫不吸附蛋白至OD280為0，然后用0～0.3 mol/L NaCl緩沖液對吸附蛋白進(jìn)行線性鹽梯度洗脫。以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，檢測各洗脫組分抑菌活性，收集活性蛋白組分，透析并冷凍干燥。

將得到的抑菌活性蛋白組分再次溶解在10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6)中，上樣于Superdex 75凝膠層析柱后，用緩沖液洗脫依次得到不同體積的緩沖液洗脫蛋白組分。以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，檢測各蛋白組分抑菌活性，收集活性蛋白組分，透析并冷凍干燥。

1.2.3 分子質(zhì)量測定 運(yùn)用Tricine-SDS-PAGE電泳法，檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。依次配制15%的分離膠、10%的夾層膠和5%的濃縮膠，插入梳子，待凝固后拔出梳子。加入SU5抗菌蛋白樣品和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker，在80 V電壓條件下進(jìn)行電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，改用30 V繼續(xù)電泳至結(jié)束。將凝膠取下，置于考馬斯亮藍(lán)G-250染色液中染色2 h，然后用脫色液脫色，觀察記錄電泳結(jié)果。

1.3 SU5抗菌蛋白QE質(zhì)譜鑒定

從Tricine-SDS-PAGE凝膠上切取含目的蛋白的膠條，將樣品交由上海中科新生命科技有限公司，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，運(yùn)用Mascot 2.2軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并檢索NCBInr等數(shù)據(jù)庫，鑒定分析蛋白質(zhì)。

1.4 SU5抗菌蛋白抑菌活性檢測

1.4.1 紙片擴(kuò)散法檢測抑菌活性 使用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制27.2 μg/mL的SU5抗菌蛋白溶液，備用。將植物病原真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落直徑為3～5 cm時，將直徑為6 mm的無菌濾紙圓片放置在距離菌落邊緣0.5 cm處，用移液槍吸取15 μL的SU5抗菌蛋白溶液加在濾紙片上，以15 μL的PBS緩沖液為對照，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)至菌落邊緣生長至濾紙片，觀察記錄試驗結(jié)果。

1.4.2 瓊脂稀釋法檢測抑菌活性 用PBS緩沖液配制2 000 μg/mL的SU5抗菌蛋白溶液，并用0.22 μm濾頭過濾除菌，然后吸取300 μL的SU5抗菌蛋白溶液與1 200 μL冷卻至50 ℃左右的0.7% PDA培養(yǎng)基混合均勻，倒入培養(yǎng)皿(30 mm×15 mm)中，以300 μL的PBS緩沖液與1 200 μL的0.7% PDA培養(yǎng)基混合為對照，待培養(yǎng)基冷凝后，將直徑為5 mm的蘋果黑腐皮殼菌菌餅接種在上述培養(yǎng)皿中心位置，最后在28 ℃恒溫條件下，培養(yǎng)至對照組菌落長至培養(yǎng)皿邊緣處，觀察記錄試驗結(jié)果。

1.4.3 孢子萌發(fā)抑制活性檢測 將蘋果黑腐皮殼菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90 mm×15 mm)中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)14 d后，制備1×107cfu/mL孢子溶液，并與0.05%的葡萄糖溶液以體積比1∶1混合。處理組取10 μL孢子溶液和10 μL不同質(zhì)量濃度的SU5抗菌蛋白溶液混合均勻，對照組取10 μL孢子溶液和10 μL的無菌水混合均勻，之后滴加在凹玻片中央，將凹玻片放入含有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿(90 mm×15 mm)中，28 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)對照組的孢子萌發(fā)率>90%時，取出凹玻片并置于4 ℃條件下，對每組孢子進(jìn)行計數(shù)，且每組孢子計數(shù)總個數(shù)不少于100個，每組做3個重復(fù)，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計算孢子萌發(fā)抑制率的公式：孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/觀察孢子數(shù)×100%；孢子萌發(fā)抑制率=(對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對照組孢子萌發(fā)率×100%。

1.5 SU5抗菌蛋白對菌絲尖端幾丁質(zhì)含量、細(xì)胞膜透性和DNA降解的影響檢測

將蘋果黑腐皮殼菌接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(90 mm×15 mm)上，待菌落生長至培養(yǎng)皿邊緣時，從邊緣處切取菌塊，放入1.5 mL含有500 μL PD液體培養(yǎng)基的離心管中，處理組中加入500 μL 1772.0 μg/mL的SU5抗菌蛋白溶液，對照組中加入500 μL的PBS緩沖液，在150 r/min、28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)1 d，然后以1個處理組和1個對照組為一組，分為3組，分別加入剛果紅、熒光綠和DAPI染料，并在室溫黑暗條件下染色30 min、60 min和30 min，然后用PBS緩沖液洗去多余染液，制作玻片，在熒光顯微鏡下觀察著色結(jié)果。

1.6 SU5抗菌蛋白離子穩(wěn)定性檢測

用PBS緩沖液配制100 μg/mL的SU5抗菌蛋白溶液，同時用無菌水分別配制20、100、200、300、400 mmol/L的KCl、MnCl2、FeCl3、CaCl2和MgCl2溶液，然后取等體積的SU5抗菌蛋白溶液與各離子溶液分別混合均勻，以等體積的無菌水和抗菌蛋白溶液混合為陽性對照，以等體積PBS緩沖液和相應(yīng)400 mmol/L的離子溶液混合為陰性對照，室溫放置2 h，最后運(yùn)用紙片擴(kuò)散法，以蘋果黑腐皮殼菌為指示菌，檢測抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SU5抗菌蛋白的純化

150 g望江南種子經(jīng)硫酸銨沉淀，得到50%～100%飽和度的沉淀蛋白組分216.36 mg，經(jīng)檢測其對蘋果黑腐皮殼菌有抑制活性。將沉淀蛋白組分溶解于20 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6)中，上樣于SP-Sepharose陽離子交換層析柱，不吸附蛋白用緩沖液洗脫后，用含有0.2、0.5、1 mol/L NaCl的緩沖液(pH值4.6)進(jìn)行鹽梯度洗脫，分別得到SP1、SP2、SP3和SP4共4個吸附蛋白組分(圖1A)。經(jīng)抑菌活性檢測，SP1蛋白組分對蘋果黑腐皮殼菌有抑制活性，收集后透析并冷凍干燥，得到SP1蛋白組分39.04 mg。將SP1蛋白組分上樣于Mone S陽離子交換層析柱，得到1個未吸附蛋白組分MS0和3個吸附蛋白組分MS1、MS2和MS3(圖1B)，其中MS3蛋白組分具有抑菌活性，收集透析并冷凍干燥，得到3.79 mg的MS3蛋白組分。將MS3蛋白組分在10 mmol/L NH4OAc緩沖液(pH值4.6)中溶解，上樣于Superdex 75凝膠層析柱，經(jīng)緩沖液洗脫，分別得到SU1、SU2、SU3、SU4、SU5、SU6、SU7和SU8洗脫蛋白組分(圖1C)。抑菌檢測結(jié)果表明，只有SU5蛋白組分對蘋果黑腐皮殼菌有抑制活性，為最終的目的蛋白，收集透析后冷凍干燥，得到SU5抗菌蛋白干粉0.44 mg。

采用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測SU5蛋白組分的分子質(zhì)量，圖1D結(jié)果顯示，SU5蛋白組分表現(xiàn)為1條帶，分子質(zhì)量約為26 ku，將其命名為SU5抗菌蛋白。

A：SP-Sepharose陽離子交換柱層析；B：Mono S陽離子交換柱層析；C：Superdex 75凝膠柱層析；D：Tricine-SDS-PAGE電泳分析(P：SU5抗菌蛋白；M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker)

2.2 SU5抗菌蛋白的QE質(zhì)譜鑒定

望江南種子SU5抗菌蛋白通過QE質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，SU5抗菌蛋白為望江南核酮糖-1,5-二磷酸羧基酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，GenBank登錄號：A0A2S0DEZ8)的大亞基蛋白片段，理論相對分子質(zhì)量為24 667.71。

2.3 SU5抗菌蛋白的抑菌活性

2.3.1 對植物病原真菌的抑制活性 圖2顯示望江南種子SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌的抑制效果，與不加入SU5抗菌蛋白的陰性對照相比，加入望江南種子SU5抗菌蛋白后，菌落的直徑變小，可知望江南種子SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌具有抑制活性。進(jìn)一步通過紙片擴(kuò)散法檢測望江南種子SU5抗菌蛋白對其他植物病原真菌的抑制活性，結(jié)果表明，望江南種子SU5抗菌蛋白對玉米小斑病菌、尖孢鐮刀菌、長丙鏈格孢菌、茄病鐮刀菌、凸臍蠕孢菌、灰葡萄孢菌、小白菜炭疽病菌、煙草炭疽病菌、芭樂炭疽病菌、稻瘟病菌和落花生球腔菌共11種植物病原真菌具有抑制活性，但是對禾谷鐮刀菌無抑制活性。綜上，望江南種子SU5抗菌蛋白對植物病原真菌具有較廣的抑制活性。

A：培養(yǎng)基含SU5抗菌蛋白的處理組；B：培養(yǎng)基含PBS緩沖液的對照組

2.3.2 對蘋果黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)的抑制活性 通過凹玻片法測定望江南種子SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)的抑制活性 (圖3)。對照組中，孢子幾乎全萌發(fā)，芽管細(xì)長，粗細(xì)均勻；與對照組相比，SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度為1.49 μg/mL時，孢子大多數(shù)萌發(fā)，芽管伸長，長度較對照組短；SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度為2.99 μg/mL時，孢子的萌發(fā)數(shù)銳減，芽管長度變短、畸形；SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度為5.98 μg/mL時，孢子膨大、畸形，幾乎不萌發(fā)；抗菌蛋白質(zhì)量濃度為11.96 μg/mL時，孢子完全不萌發(fā)。

SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度分別為A：11.96 μg/mL；B：5.98 μg/mL；C：2.99 μg/mL；D：1.49 μg/mL；E：0 μg/mL

經(jīng)統(tǒng)計，SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度為1.49 μg/mL時，對孢子幾乎無抑制作用，伴隨著SU5抗菌蛋白質(zhì)量濃度的增大，孢子萌發(fā)抑制率逐漸升高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到11.96 μg/mL時，SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌的孢子萌發(fā)抑制率為100.00%(表1)。

2.4 SU5抗菌蛋白對菌絲尖端幾丁質(zhì)含量、細(xì)胞膜透性和DNA降解的影響

2.4.1 對蘋果黑腐皮殼菌菌絲尖端幾丁質(zhì)含量的影響 剛果紅是幾丁質(zhì)染料，可與幾丁質(zhì)結(jié)合，用來指示望江南種子SU5抗菌蛋白作用下，蘋果黑腐皮殼菌菌絲尖端幾丁質(zhì)的積累情況，結(jié)果見圖4。對照組中，菌絲內(nèi)未見紅色熒光亮點，而在SU5抗菌蛋白處理組中，菌絲尖端可見明顯的紅色熒光亮點。由此可知，望江南種子SU5抗菌蛋白抑制蘋果黑腐皮殼菌時，導(dǎo)致菌絲尖端幾丁質(zhì)的積累，抑制蘋果黑腐皮殼菌的生長。

表1 望江南種子SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)的抑制率Tab.1 The inhibition rate of SU5 antifungal protein from Cassia occidentalis seeds toward spore germination of Valsa mali

P：SU5抗菌蛋白處理組；CK：PBS緩沖液對照組。下同

2.4.2 對蘋果黑腐皮殼菌菌絲細(xì)胞膜透性的影響 熒光綠可穿過胞膜受損的細(xì)胞，使核酸著色，用來檢測望江南種子SU5抗菌蛋白作用時，對蘋果黑腐皮殼菌菌絲細(xì)胞膜透性的影響，結(jié)果見圖5。對照組中，菌絲內(nèi)未檢測到綠色熒光，而SU5抗菌蛋白處理組的菌絲內(nèi)，可檢測到明顯的綠色熒光亮點，因而，望江南種子SU5抗菌蛋白作用于蘋果黑腐皮殼菌時，菌絲細(xì)胞膜的完整性被破壞，使得細(xì)胞膜透性發(fā)生改變，從而抑制菌絲生長。

圖5 蘋果黑腐皮殼菌菌絲熒光綠染色熒光顯微鏡觀察

2.4.3 對蘋果黑腐皮殼菌菌絲DNA降解的影響 DAPI是細(xì)胞核染料，可與DNA結(jié)合，將其作為檢測SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌菌絲DNA降解作用的指示劑，檢測結(jié)果見圖6。對照組中，菌絲內(nèi)的熒光成規(guī)律的圓點狀，均勻分布于菌絲內(nèi)。SU5抗菌蛋白處理組的菌絲內(nèi)熒光形狀不規(guī)律，散布于菌絲內(nèi)。因而，望江南種子SU5抗菌蛋白抑制蘋果黑腐皮殼菌時，導(dǎo)致菌絲細(xì)胞DNA碎片化、降解，使得菌絲DNA結(jié)構(gòu)被破壞，不規(guī)則地分布于菌絲內(nèi)。

圖6 蘋果黑腐皮殼菌菌絲DAPI染色熒光顯微鏡觀察Fig.6 Fluorescence microscope images of Valsa mali hyphae stained with DAPI

2.5 SU5抗菌蛋白的離子穩(wěn)定性

由表2可知，在10～200 mmol/L的K+、Mn2+和Fe3+條件下，SU5抗菌蛋白仍具有抑菌活性；在濃度為10 mmol/L的Ca2+和Mg2+處理后，SU5抗菌蛋白具有抑菌活性，而在Ca2+和Mg2+濃度為50～200 mmol/L時，SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌的抑制活性消失。綜上，K+、Mn2+和Fe3+對望江南種子SU5抗菌蛋白的抑菌活性不產(chǎn)生影響，而Ca2+和Mg2+可抑制SU5抗菌蛋白的抑菌活性。

表2 望江南種子SU5抗菌蛋白在不同離子條件下的穩(wěn)定性檢測結(jié)果Tab.2 The stability of SU5 antifungal protein from Cassia occidentalis seeds under different ions conditions

注：+表示對蘋果黑腐皮殼菌有抑制活性；-表示對蘋果黑腐皮殼菌無抑制活性。

Note：+ represents inhibition activity towardValsamali；- represents no inhibition activity towardValsamali.

3 結(jié)論與討論

望江南種子SU5抗菌蛋白(約26 ku)，與桑氏鏈霉菌KJ07抗菌蛋白的分子質(zhì)量(28.4 ku)相近[14]，而比望江南種子蛋白質(zhì)提取物(約為14 ku)[8]、芝麻菜種子ZSU2抗菌蛋白(12 ku)[15]和紫菜薹種子抗菌蛋白(13 ku)[16]的分子質(zhì)量大。

望江南種子SU5抗菌蛋白抑菌活性對K+、Mn2+和Fe3+保持穩(wěn)定，而被Ca2+和Mg2+所抑制。桑氏鏈霉菌KJ07抗菌蛋白在Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Li+處理后，抑菌活性增加，而經(jīng)Cu2+、Fe3+、Zn2+處理后，抑菌活性被抑制[14]。紫菜薹種子抗菌蛋白在K+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Pb2+、Al3+、Fe3+和Cr3+金屬離子處理后，抑菌活性不受影響，而經(jīng)Ca2+和Mn2+處理后，抑菌活性被抑制[16]。芝麻菜抗菌蛋白ZSU2在20～150 mmol/L的Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+和20～100 mmol/L的Fe3+處理后，抑菌活性不受影響，而在150 mmol/L的Fe3+處理后，其抑菌活性明顯減弱[15]。比較發(fā)現(xiàn)，望江南種子SU5抗菌蛋白對金屬離子的穩(wěn)定性不如桑氏鏈霉菌KJ07抗菌蛋白、紫菜薹種子抗菌蛋白和芝麻菜ZSU2抗菌蛋白，其原因可能是望江南種子SU5抗菌蛋白本身是一種酶，而蛋白酶的活性更易受環(huán)境影響。

本試驗結(jié)果表明，SU5抗菌蛋白能抑制12種植物病原真菌，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。VASUDEV等[8]的試驗表明，望江南種子蛋白質(zhì)提取物能抑制煙草赤星病菌、黑斑病菌和尖孢鐮刀菌。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，望江南種子提取物對人體致病細(xì)菌和真菌具有很強(qiáng)的抑制活性[17-19]。因而,望江南種子抑菌活性蛋白在實際應(yīng)用中具有一定的潛力。

望江南種子SU5抗菌蛋白能引起蘋果黑腐皮殼菌菌絲尖端幾丁質(zhì)的積累、細(xì)胞膜透性發(fā)生改變和DNA降解。GHOSH等[20]對大蒜葉凝集素類抗菌蛋白的研究結(jié)果表明，抗菌蛋白能夠引起立枯絲核菌細(xì)胞膜透性改變和DNA降解。紫甘藍(lán)種子抗菌蛋白能引起落花生球腔菌的菌絲尖端出現(xiàn)幾丁質(zhì)積累的現(xiàn)象[21]。

綜上，望江南種子SU5抗菌蛋白對植物病原真菌具有一定的抑制活性，但是由于未檢測其對具體植物病原真菌的最小抑菌濃度和半抑制濃度，因而不能對其抑菌活性與其他抗菌蛋白進(jìn)行比較。在后續(xù)研究中，需測定望江南種子SU5抗菌蛋白對蘋果黑腐皮殼菌的半抑制濃度，并進(jìn)一步運(yùn)用分子生物學(xué)手段，研究其抑菌機(jī)制。