引發劑對黃芩種子萌發及幼苗耐旱性的影響

李小玲，華智銳，許 肖

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)又名山茶根，別名為土金茶根，藥用歷史悠久，與丹參、連翹、桔梗、五味子并稱為中國秦嶺五大商藥[1]，具有抗菌、消炎、調節血脂和抗艾滋病病毒等功效[2]，主產于河北、遼寧、陜西、山東、內蒙古及黑龍江等地。近年來，黃芩作為藥材被廣泛用于治療臨床各種疾病，市場對于藥用黃芩的需求量大大增加，人們過度采挖造成野生黃芩越來越少，已不能滿足市場的需求。因此，人工栽培品種成為藥用黃芩的主要來源。研究發現，黃芩生長發育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中干旱是制約黃芩產量和品質的主要因子之一[3]。干旱脅迫可導致植物細胞內積累大量活性氧，引起膜脂過氧化，導致膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)含量顯著增加，嚴重破壞細胞膜和其他生物大分子的結構和功能[4]，從而影響黃芩的生長發育，制約黃芩產業的可持續發展。因此，近年來關于植物的抗旱生理研究備受關注[5-6]，同時也對植物的抗旱性提出了新的要求。研究植物抗旱機制時發現，通過外施某種引發劑可以提高植物的抗旱性。

種子引發是基于種子萌發生物學機制提出的一種種子處理技術[7]，其優點是可以促進種子萌發、打破種子休眠、增加種子活力、提高種子發芽潛力、提高幼苗抗性、改善營養狀況[8]。研究發現，一定劑量的種子引發劑能夠提高種子的發芽率和發芽勢；提高幼苗的葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量；提高幼苗的過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性[9]。如低濃度的NaCl和Na2SO3引發劑可以促進干旱脅迫下少花蒺藜草及鹽蒿種子的萌發，提高種子的發芽勢、發芽率和發芽指數，緩解干旱脅迫對植物的傷害，降低MDA含量，提高葉片SOD、POD、CAT活性及葉綠素含量[10-11]。目前，關于植物種子引發的研究主要集中在農作物[12-13]、蔬菜[14-15]、黃芪[16]、桔梗[17]、白花蛇舌草[18]等，在藥用植物黃芩上的報道很少，種子引發對黃芩幼苗耐旱性的影響目前也尚未見報道。前期研究表明，采用20% PEG-6000處理黃芩可以模擬干旱環境[5-6]。基于此，以商洛黃芩為材料，探討了單引發劑(NaCl、Na2SO3、CaCl2)和復合引發劑(NaCl、Na2SO3、CaCl2不同配比濃度)對黃芩種子萌發和幼苗耐旱性的生理效應，旨在尋找適宜黃芩的種子引發劑，為干旱地區種植黃芩提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試黃芩種子及幼苗于2018年4月初購自商洛市洛南縣藥材種植基地。NaCl、CaCl2和Na2SO3為分析純試劑(含量≥99.5%)，購自陜西晶博生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子引發處理 選取大小一致、飽滿成熟的黃芩種子(千粒質量約10.5 mg)，用3% H2O2消毒5 min，經蒸餾水反復沖洗后，擦干其表面水分備用。采用紙上發芽床法，在洗凈、烘干的培養皿(直徑90 mm)中鋪雙層濾紙，并加入相應的引發溶液和20%PEG-6000，共計11個引發處理，具體見表1。各取預處理備用的黃芩種子42粒整齊地放入培養皿中，以加入等量蒸餾水(CK1)和20% PEG-6000溶液(干旱脅迫，CK2)分別作為對照,置入生化培養箱中培養，培養溫度設晝/夜為25 ℃/18 ℃，相對濕度為75%，光照強度為200 μmol/(m2·s),光周期晝/夜為14 h/10 h。每個處理重復3次，24 h后繼續噴灑20% PEG-6000及相應的種子引發劑，并及時補水，每天觀察其生長狀況，5 d后觀察并記錄種子的發芽勢，7 d后觀察并記錄發芽率。

表1 黃芩種子及幼苗引發處理Tab.1 Priming treatment settings for seeds and seedlings of Scutellaria baicalensis

1.2.2 黃芩幼苗引發處理 幼苗試驗共設蒸餾水(CK1)、20% PEG-6000(干旱脅迫，CK2)2個對照以及11個引發處理(表1),11個引發處理同時采用20% PEG-6000進行干旱脅迫。選取長勢基本相同的1年生黃芩幼苗，均勻分配于39個規格為15 cm×18 cm的花盆中栽培并標上序號，每盆3株，每天早上8：00給黃芩幼苗葉片正反面噴施蒸餾水、單引發劑、復合引發劑及20% PEG-6000，并于12：00進行澆水(防止水分過分流失造成黃芩幼苗死亡)，連續噴施7 d后取樣測定幼苗生理指標。

1.3 測定項目

種子萌發指標測定參照王治江等[19]的方法，每天記錄種子的萌發狀態，計算發芽率和發芽勢。

發芽率=(7 d內發芽的種子數/供試種子數)×100%，發芽勢=(5 d內發芽的種子數/供試種子數)×100%。

可溶性蛋白含量測定參照張志良等[20]的考馬斯亮藍G-250法；MDA含量測定參照潘瑞熾[21]的硫代巴比妥酸法；脯氨酸含量測定參照王立紅等[22]的茚三酮法；POD活性測定參照朱廣廉[23]的愈創木酚顯色法；葉綠素含量測定參照李合生[24]丙酮-碳酸鈣法；CAT活性測定參照郝再彬等[25]的紫外吸收法；SOD活性測定參照高俊鳳[26]的氮藍四唑(NBT)光還原法。

1.4 數據處理及分析

所有處理每次測定重復3次，數據為3次測定值的平均值，用Excel 2010進行數據處理和繪圖，采用SPSS 22.0軟件對數據進行ANOVA方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 引發劑對黃芩種子發芽率、發芽勢的影響

從表2可以看出，與正常處理(CK1)相比，干旱脅迫(CK2)下黃芩種子的發芽勢和發芽率顯著降低，其中，發芽勢降低60.35%、發芽率降低56.77%。0.4% NaCl處理(T1)、10 mmol/L Na2SO3處理(T2)、20 mmol/L CaCl2處理(T3)的種子發芽勢和發芽率均較CK2顯著提高，T1處理發芽勢和發芽率較CK2分別增加39.66%和29.34%，T2處理發芽勢和發芽率較CK2分別增加43.72%和39.89%， T3處理發芽勢和發芽率較CK2分別增加120.47%和103.66%。T1與T2處理發芽勢無顯著差異，但與CK2相比均達到顯著水平(P<0.05)。可見，3種單引發劑處理相比，T3處理的發芽勢和發芽率較干旱脅迫(CK2)增幅最大，說明單引發劑以20 mmol/L CaCl2緩解干旱脅迫不良影響的效果最佳。

表2 單引發劑對黃芩種子發芽率、發芽勢的影響Tab.2 Effect of single initiator on germination rate and vigor of Scutellaria baicalensis Georgi

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05),the same below.

從表3可知，當加入不同配比濃度的復合引發劑后，與CK2相比，各處理發芽勢和發芽率均有所增加，其中，T4處理黃芩種子的發芽勢和發芽率最高，較CK2分別增加97.91%和86.94%；T6處理黃芩種子的發芽率最低(19.13%)，但仍較CK2增加4.54%；T8處理黃芩種子的發芽勢最低(17.15%)，但仍較CK2增加15.88%。T6、T9、T10處理間發芽率差異不大；T5、T6、T7、T9、T10處理間發芽勢無顯著差異，但均較CK2顯著提高。可見，0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理(T4)可顯著提高干旱脅迫下黃芩種子的發芽勢和發芽率。

表3 復合引發劑對黃芩種子發芽率、發芽勢的影響Tab.3 Effect of complex initiator on germination rate and vigor of Scutellaria baicalensis Georgi

2.2 引發劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響

植物體內的保護酶系能夠清除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質。但在干旱條件下，植物體內積累大量的活性氧最終會影響膜的通透性。從表4、表5可以看出，干旱脅迫下(CK2)黃芩幼苗體內SOD、CAT、POD活性較對照(CK1)顯著降低，當噴施一定量的引發劑后黃芩幼苗保護酶系活性均有所提高。

從表4可知，干旱脅迫下(CK2)，黃芩幼苗的SOD、CAT、POD活性均較對照(CK1)顯著降低，噴施不同的單引發劑后，黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性均較CK2顯著上升。0.4%NaCl處理(T1)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加41.75%、82.24%、80.29%；10 mmol/L Na2SO3處理(T2)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加26.25%、25.98%、34.31%；20 mmol/L CaCl2處理(T3)黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加32.64%、54.19%、44.53%。其中，T2處理POD活性與CK1無顯著差異，但顯著高于CK2。可見，3種單引發劑相比， T1處理的增幅最大，說明噴施0.4% NaCl處理緩解干旱脅迫的不良影響效果最佳，黃芩體內SOD、CAT、POD活性相對較高，可顯著降低黃芩體內活性氧的積累，從而減輕對細胞的傷害。

表4 單引發劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響 Tab.4 Effects of single initiator on activities of SOD,CAT and POD in Scutellaria baicalensis seedlings

從表5可知，噴施不同配比濃度的復合引發劑后，黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性均較CK2顯著增加。其中，以復合引發劑0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理(T8)效果最佳，SOD、CAT、POD活性較CK2分別增加34.42%、64.80%、65.69%，可見，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片中SOD、CAT、POD的活性。

表5 復合引發劑對黃芩幼苗SOD、CAT、POD活性的影響Tab.5 Effect of complex initiator on activities of SOD,CAT and POD in Scutellaria baicalensis seedlings

2.3 引發劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響

從圖1可以看出，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗葉綠素含量較CK1降低46.22%，噴施不同單引發劑后，黃芩幼苗葉綠素含量明顯上升，具體表現為T1、T2、T3處理較CK2分別增加147.75%、121.35%、107.30%。綜合分析認為，3種單引發劑中以0.4%NaCl處理緩解干旱脅迫不良影響的效果最佳，葉綠素含量增幅最大。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),the same below圖1 單引發劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of single initiator on chlorophyll content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖2可知，噴施不同配比濃度的復合引發劑后，黃芩幼苗的葉綠素含量均較CK2顯著增加，其中，T8處理黃芩幼苗的葉綠素含量最高(3.82 mg/g)，較CK2增加114.61%；T11處理黃芩幼苗的葉綠素含量最低(2.32 mg/g)，但仍較CK2增加30.34%；CK1與T5處理間無顯著差異，但均顯著高于CK2(P<0.05)。可見，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2(T8處理)可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗的葉綠素含量。

圖2 復合引發劑對黃芩幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of complex initiator on chlorophyll content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.4 引發劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

由圖3可知，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗的脯氨酸含量較CK1顯著降低，當噴施不同單引發劑后黃芩幼苗的脯氨酸含量增加，具體表現為T1、T2、T3處理較CK2分別增加166.47%、72.36%、112.84%。3種單引發劑相比，T1處理增幅最大，說明單引發劑中0.4% NaCl處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最高，緩解干旱脅迫的效果最佳。

圖3 單引發劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of single initiator on proline content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖4可知，噴施不同配比濃度的復合引發劑后黃芩幼苗的脯氨酸含量均較CK2顯著增加，其中，T8處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最高(16.34 μg/g)，較CK2增加146.83%；T11處理黃芩幼苗的脯氨酸含量最低，但仍較CK2增加8.76%。綜上，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2(T8處理)可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗的脯氨酸含量。

圖4 復合引發劑對黃芩幼苗脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of complex initiator on proline content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.5 引發劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響

從圖5可以看出，干旱脅迫(CK2)下黃芩幼苗的可溶性蛋白含量較CK1顯著降低，噴施不同單引發劑后黃芩幼苗的可溶性蛋白含量增加，具體表現為0.4% NaCl(T1)、10 mmol/L Na2SO3(T2)、20 mmol/L CaCl2(T3)處理較CK2分別增加182.47%、101.30%、130.52%。3種單引發劑相比，T1增幅最大，說明單引發劑處理中以0.4%NaCl緩解干旱脅迫效果最佳，黃芩葉片中可溶性蛋白含量與其他處理相比最高。

圖5 單引發劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of single initiator on soluble protein content of Scutellaria baicalensis seedlings

從圖6可知，與CK1相比，干旱脅迫下(CK2)黃芩幼苗葉片內的可溶性蛋白含量降低，當噴施不同配比濃度的復合引發劑后黃芩幼苗葉片的可溶性蛋白含量均增加，增幅均達到顯著水平(P<0.05),且在T8時黃芩幼苗葉片的可溶性蛋白含量達到最大值(1.52 mg/g)，較CK2增加146.75%，效果最明顯。而T9與T10處理之間無顯著差異，但與CK2相比均達到顯著水平(P<0.05)。結果表明，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片中可溶性蛋白的含量。

圖6 復合引發劑對黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of complex initiator on soluble protein content of Scutellaria baicalensis seedlings

2.6 引發劑對黃芩幼苗MDA含量的影響

從圖7可看出，干旱脅迫(CK2)下，黃芩幼苗MDA含量較CK1顯著升高；噴施不同的單引發劑后黃芩幼苗MDA含量降低，具體表現為T1、T2、T3處理較CK2分別降低65.94%、54.38%、59.71%。3種單引發劑相比，T1處理黃芩幼苗MDA含量降幅最大，說明單引發劑中以0.4% NaCl處理緩解干旱脅迫的效果最佳，MDA含量最低。

從圖8可知， 噴施不同配比濃度的復合引發劑后，干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量均顯著降低,其中，T8處理黃芩幼苗MDA含量最低(5.62 nmol/g)。可見，噴施0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2可顯著降低干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量。

圖7 單引發劑對黃芩幼苗MDA含量的影響Fig.7 Effect of single initiator on malondialdehyde content of Scutellaria baicalensis seedlings

圖8 復合引發劑對黃芩幼苗MDA含量的影響Fig.8 Effect of complex initiator on malondialdehyde content of Scutellaria baicalensis seedlings

3 結論與討論

在正常情況下，植物體內的滲透調節及各項調節機能維持著一個相對平衡的狀態。當受到外界逆境脅迫后，其各項調節功能遭到破壞，嚴重時會影響植物的生長發育。本研究結果表明，在干旱脅迫下，黃芩幼苗的可溶性蛋白、葉綠素、脯氨酸含量明顯降低，保護酶活性也受到嚴重影響。

黃芩種子在干旱環境下的萌發特性是決定黃芩能否在干旱脅迫下成功栽培的關鍵因素之一。本研究發現，干旱脅迫降低了黃芩種子的發芽勢和發芽率，當外施一定濃度的單引發劑和復合引發劑后，黃芩種子的發芽勢和發芽率均有明顯提高，這與何軍等[16]的研究結果相似。從試驗結果可以看出，單引發劑20 mmol/L CaCl2處理和復合引發劑0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最好。說明一定濃度的引發劑可以打破種子的休眠狀態，調節體內的滲透壓平衡，促進種子的呼吸作用，提高體內的調節酶活性，促進植物種子的萌發，使種子的發芽速度和整齊度得到根本改善[27]。

MDA含量是植物細胞膜脂過氧化程度的體現，一般情況下，MDA含量越高說明植物細胞膜脂過氧化程度越高，細胞受到的傷害越大。本研究表明，干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量明顯升高，加入不同引發劑后MDA含量明顯下降，其中，單引發劑中以0.4% NaCl處理黃芩幼苗MDA含量最低；復合引發劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，黃芩幼苗MDA含量低于其他復合引發劑處理，這與王治江等[19]的研究結果一致。由此可見，一定濃度的引發劑能夠抑制膜脂過氧化，減輕對細胞的損傷，從而提高植物的耐旱性。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，葉綠素含量的高低直接決定植物光合作用能力的高低，同時也是評判植物耐旱能力的重要指標。脯氨酸和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節物質，能增強植物保持水分的能力，保證植物的正常代謝。本試驗結果表明，單引發劑中以0.4% NaCl處理效果最佳，黃芩幼苗葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量最高；采用復合引發劑處理黃芩幼苗，其中以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，黃芩幼苗葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量較其他復合引發劑處理高；2種引發劑相比較，以單引發劑處理黃芩幼苗效果最好。可見，一定濃度的引發劑可以提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白含量，這與馬超等[13]的研究結果相似。

在正常生理狀態下，植物體內活性氧的產生和清除保持著相應的動態平衡，當遭受到逆境脅迫時這個平衡被破壞，此時植物體內的保護酶系統會起到一定的抵抗作用，其中SOD是將氧自由基分解為H2O2和水的關鍵酶[1]，CAT和POD起協同作用，共同作用清除體內的H2O2。本研究表明，單引發劑中以0.4% NaCl處理效果最佳，復合引發劑處理黃芩幼苗以0.4%NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2處理效果最佳，2種引發劑相比較以單引發劑處理效果最好，黃芩幼苗保護酶活性最高，表明一定的引發劑可提高干旱脅迫下黃芩幼苗葉片的保護酶活性。

本研究結果表明，施用不同的引發劑可以不同程度地緩解干旱脅迫對黃芩種子和幼苗所造成的傷害。單引發劑處理種子以20 mmol/L CaCl2效果最好，復合引發劑處理種子以0.3% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2效果最佳，2種引發劑相比以單引發劑處理效果較佳。單引發劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl效果最佳，復合引發劑處理黃芩幼苗以0.4% NaCl+5 mmol/L Na2SO3+15 mmol/L CaCl2效果最佳，2種處理比較以0.4% NaCl處理效果較佳，黃芩幼苗的葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸含量以及SOD、POD、CAT活性均高于其他引發劑處理。