鐵皮石斛纖維素合成酶超級基因家族生物信息學分析

蘭曉天，胡 淞，馮 磊，田英男，和鳳美

(云南農業大學 園林園藝學院，云南 昆明 650601)

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)，屬蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是石斛屬藥用植物中珍稀名貴的品種[1]。鐵皮石斛多糖含量和纖維素含量的高低是判斷其品質優良與否的關鍵，其中，纖維素含量越少品質越高[2]。研究鐵皮石斛纖維素的合成過程，挖掘纖維素合成過程中的重要基因，進而通過植物基因工程方式減少纖維素含量，可為培養優良鐵皮石斛品種提供重要理論支持。

纖維素是植物細胞壁的主要成分，植物纖維素的合成是多個基因共同作用的結果，主要包含纖維素合成酶基因(CESA)和類纖維素合成酶基因(CSL)2個基因家族成員[3-5]。纖維素合成酶的主要功能是負責在質膜上催化纖維素的生物合成；高爾基體體腔中的半纖維素合成則主要由類纖維素合成酶來完成。隨著基因組學的發展，已有1 400多個[6]不同物種的CESA基因序列被克隆并報道出來。鐵皮石斛中已有89個CESA基因被鑒定出來，此外，還發現DoCSLA6基因不僅直接參與鐵皮石斛多糖合成的代謝途徑，還與鐵皮石斛的抗逆性有關[7]。近年來，人們對水稻、擬南芥、棉花、毛果楊和煙草等[8-11]植物的CESA基因家族進行了生物信息學分析和比較。雖然CESA一直是植物纖維素合成研究的一個熱點，但相關研究主要集中在模式植物中，關于鐵皮石斛CESA/CSL基因家族的研究尚未見報道。本研究利用鐵皮石斛的轉錄組數據，挖掘在鐵皮石斛莖中表達量高的纖維素合成酶家族基因，構建鐵皮石斛CESA基因家族和CSL基因家族的系統進化樹，并對它們的基因結構、保守結構域、亞細胞定位等進行分析，為鐵皮石斛CESA/CSL蛋白的功能研究和鐵皮石斛新品種的培育奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 基于轉錄組的鐵皮石斛纖維素合成酶家族基因表達模式分析

鐵皮石斛取于云南農業大學溫室大棚內。在花朵初開時，取下整株鐵皮石斛包括根、莖、葉和花進行轉錄組測序。從鐵皮石斛轉錄組數據中獲得CESA、CSL基因的表達數據，分析其根、莖、葉和花中表達量的差異。

1.2 擬南芥、水稻、鐵皮石斛纖維素合成酶家族基因的獲得

分別下載擬南芥(http://www.Arabidopsis.org/) 和水稻(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)基因組中所有的CESA、CSL基因序列以及對應的蛋白質序列數據。從鐵皮石斛轉錄組NR注釋中獲取鐵皮石斛的纖維素合成酶家族基因，并選擇在鐵皮石斛莖中表達量高(FPKM>1)的基因序列。將獲得的鐵皮石斛CESA/CSL基因在Clustal W中進行比對，去除同源性高的基因。

1.3 纖維素合成酶家族基因多序列比對和系統進化樹構建

將獲得的鐵皮石斛、擬南芥和水稻的CESA基因和CSL基因用軟件ClustalX 進行氨基酸序列比對，去除同源性較高和距離遠的基因，再用MEGA 5.0軟件構建進化樹。

1.4 纖維素合成酶家族基因結構分析

選取在鐵皮石斛莖中表達量較高的CESA和CSL基因，通過在線分析工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對基因序列和CDS序列進行基因結構分析[12]。

1.5 纖維素合成酶的保守結構域、跨膜結構和亞細胞定位預測

利用在線分析系統SMART analysis service(http://smart.Emblheidelberg.de/)[13]對鐵皮石斛CESA、CSL蛋白保守結構域進行分析；通過在線 TMHMM Server V.2.0分析系統(http://www.cbs.dtu.dk /services/TMHMM)[14]預測鐵皮石斛CESA、CSL蛋白的跨膜結構；通過在線 WoLF PSORT系統(http://wolfpsort.org/)對蛋白質的亞細胞定位進行預測[15]。

2 結果與分析

2.1 纖維素合成酶基因在鐵皮石斛根、莖、葉、花中的表達

從鐵皮石斛轉錄組中鑒定出62個CESA/CSL基因，這些基因在根、莖、葉、花中表達量的FPKM值見圖1。其中，有19個基因的FPKM值均小于1，說明這些基因在鐵皮石斛中表達量較低或不表達。有36個基因在4個組織中均有表達。其中，De10015261、De10044519和De10126237基因只在鐵皮石斛的根中表達，De10015633和De10018596僅在莖中表達，De10061728僅在葉片中表達；De10002879在根和莖2個部位進行表達，De10070863、De10045267和De10016931只在地上組織中表達。De10085680、De10044516在莖和花中表達，De10032436在根和花中表達，De10002966在莖中無表達而在根、葉、花中均有表達。

圖1 鐵皮石斛轉錄組中CESA、CSL基因的FPKM值Fig.1 FPKM of CESA and CSL genes in the transcription group of Dendrobium candidum

2.2 纖維素合成酶基因系統進化樹的構建

在鐵皮石斛轉錄組中選出在莖中表達量(FPKM值)>1的CESA/CSL基因,將獲得的這些序列在Clustal W中進行比對，去除同源性高的基因，最終獲得32個在莖中高表達量的CESA/CSL基因。采用MEGA 5.0對這些基因與水稻和擬南芥的CESA/CSL基因家族構建系統進化樹(圖2)。結果表明，鐵皮石斛CESA/CSL基因主要聚為6個明顯的分支。可將CESA/CSL基因分為CESA、CSL2類，而CSL基因又被細分為5亞族，分別命名為CSLA、CSLG、CSLD、CSLE與CSLH。其中，De10069041、De10040587、De10044972、De10083985、De10040239、De110044623屬于CESA家族；De10085679、De10085680、De10085688、De10127097、De10127099屬于CSLA家族；De10101415、De10101413、De10070864、De10070863、De10070859、De10070849、De10046345、De10012016聚類于CSLG家族；De10006938、De10013367、De10015166、De10016276聚類于CSLE家族；De10082462聚類于CSLH家族；De10005136、De10033113、De10013676、De10013675、De10032947、De10065574、De10105279、De10058146聚類于CSLD家族。

圖2 鐵皮石斛、水稻和擬南芥纖維素合成酶基因家族系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of CESA/CSL family genes in Oryza，Arabidopsis and Dendrobium

2.3 鐵皮石斛CESA/CSL基因家族的基因結構分析

基因結構分析(圖3)表明，鐵皮石斛CESA基因家族中具有13、14個外顯子的基因各2個，具有20、21個外顯子的基因各1個。鐵皮石斛CESA基因家族在外顯子數目上的差異較大。通過對擬南芥CESA基因序列進行分析發現，基因之間的差異性在于某些區域是否存在內含子，鐵皮石斛的6個CESA基因之間差別較大。在鐵皮石斛26個CSL基因中，外顯子數量為1～13個。在CSLA基因家族中含7個外顯子和6個外顯子的基因各有2個，5個外顯子的基因有1個。在CSLG基因家族中外顯子數目為1～7個，差異很大。在CSLE基因家族中，3個基因含有6個外顯子，1個基因含有13個外顯子。CSLH基因家族中De10082462含有9個外顯子。CSLD家族中，除了De10105279有7個外顯子，其余7個基因的外顯子數為1～4個。

2.4 鐵皮石斛CESA、CSL蛋白的保守結構域、跨膜結構和亞細胞定位預測

鐵皮石斛CESA、CSL蛋白的保守結構域分析(表1)表明，鐵皮石斛的CESA蛋白都含有該家族的保守結構域RING 和Cellulose synthase；CSL蛋白中除CSLA外，其余各組均含有保守結構域Cellulose synthase。根據蛋白質跨膜預測系統TMHMMServer V.2.0分析，鐵皮石斛CESA/CSL蛋白大部分都含有跨膜結構，跨膜結構域數量0～12個。蛋白質亞細胞定位預測結果表明，鐵皮石斛CESA/CSL蛋白大部分位于質膜上(24個)；De10013676、De10070863、De10070864、De10070849和De10127099編碼的蛋白質位于葉綠體上；De10005136、De10070859、De10012016編碼的蛋白質位于細胞核。

圖3 鐵皮石斛CESA和CSL基因的結構分析 Fig.3 Structure analysis of CESA and CSL family genes in Dendrobium candidum

表1 鐵皮石斛CESA和CSL蛋白特性 Tab.1 CESA and CSL characteristics of Dendrobium candidum

續表1 鐵皮石斛CESA和CSL蛋白特性 Tab.1(Continued) CESA and CSL characteristics of Dendrobium candidum

3 結論與討論

近年來，人們對于CESA/CSL基因家族的研究主要集中于CESA基因且集中于水稻、擬南芥、棉花、毛竹和煙草等經典植物上，而對于鐵皮石斛CESA/CSL基因家族的研究鮮見報道。通過生物信息學分析可以預測纖維素合成酶基因的作用原理，推測基因家族的進化機制，減少試驗的工作量和盲目性。通過構建系統發育樹，利用進化樹中已知功能的基因可以預測同一分支基因的功能。已知擬南芥中的纖維素合成酶基因ATCESA6、ATCESA1[16]參與初生細胞壁的纖維素合成，ATCESA4、ATCESA7、ATCESA8與次生細胞壁合成相關[17]。水稻中[18]纖維素合成酶基因OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9與細胞次生壁纖維素合成有關。根據本研究結果可以推測，De10040587、De10044972、De10083985、De10040239基因與初生細胞壁的纖維素合成有關，De110044623、De10069041基因與次生細胞壁合成相關。CSL基因家族與CESA基因家族具有很高的相似性，但功能各不相同。其中，CSLA基因家族成員參與甘露聚糖和葡甘露聚糖的合成[19]；CSLG基因家族[20]主要參與細胞壁內多糖合成；CSLD基因家族[21]影響細胞的延伸和擴張，細胞的擴增和分裂也與之有關系；葡聚糖的合成則與CSLH基因家族有關[22]。由此可以推測，De10085679、De10085680、De10085688、De10127097和De10127099可能與甘露聚糖和葡甘露聚糖的合成相關；De10101415、De10101413、De10070864、De10070863、De10070859、De10070849、De10046345、De10012016與細胞壁內多糖合成有關；De10005136、De10033113、De10013676、De10013675、De10032947、De10065574、De10105279、De10058146可能影響植株的高矮和分蘗；De10082462與細胞壁的延伸有關。

植物體內存在多種纖維素合成酶，不同的纖維素合成酶基因在植物不同部位表達，一種纖維素合成酶基因可能參與多個組織或多種細胞壁結構中纖維素的合成，也有可能只參與某一特定部位的合成，具有組織表達的特異性[23-24]。楊樹[25]PtrCesA2和PtrCesA1基因都是在木質部次生壁形成期表達。阮維程等[26]對馬尾松纖維素合成酶基因PmCesA1進行定量PCR分析，得出PmCesA1基因在馬尾松的嫩枝、葉、根中均有表達，但表達量卻各不相同，其在嫩枝中的相對表達量最高(2.53)，在葉中的相對表達量最低(1.25)，在根中的相對表達量居中(1.82)。本研究發現，從鐵皮石斛轉錄組中鑒定出的62個纖維素合成酶基因在根、莖、葉、花中表達的個數不同，表達量也不相同。

本研究通過對鐵皮石斛轉錄組中高表達量的CESA/CSL基因進行生物信息學分析，共鑒定出32個基因，可分為兩大類，6個亞族。該基因家族各成員之間的外顯子數目和基因全長具有很大差異，可能是因為不同成員之間的功能差別較大。對保守結構進行分析發現，鐵皮石斛CSL家族蛋白質除CSLA外均含有保守結構域Cellulose synthase，而CESA家族蛋白質均含有保守結構域 RING。鐵皮石斛CESA/CSL蛋白主要分布于質膜上，大部分具有跨膜結構域，跨膜結構域數量0～12個。