寧春4號與河東烏麥雜交F2產量相關性狀和抗病性及其QTL分析

王掌軍，劉 妍，王志蘭，喬 丹，石冰欣，盧春甜，劉鳳樓，李清峰，張曉崗，劉生祥

(1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021；3.黑龍江禾田豐澤興農科技開發有限公司，黑龍江 哈爾濱 150028)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國重要的糧食作物，其高產對于保障我國糧食安全具有十分重要的意義。想要提高小麥產量，不僅要考慮產量構成因素的協調關系[1-2]，還要培育和推廣抗病品種[3]。小麥有效分蘗數是影響產量的主要因素之一[4-7]，發掘控制分蘗數的QTL對于高(穩)產育種具有重要意義。湯穎子[8]檢測到14 個控制分蘗數的QTL；丁安明等[9]找到分布于11條染色體上的15個與有效分蘗數相關的QTL；MARZA等[10]在3BS染色體上檢測到1個與有效分蘗數相關的QTL；畢曉靜[11]檢測到控制有效分蘗數的6個QTL 。穗數、穗粒數和粒質量是小麥產量構成三要素。穗粒數對產量形成具有較大貢獻[12]。有研究表明，我國小麥品種穗粒數優異等位基因在傳統育種選擇過程中經歷了強烈的正向選擇[13]。LIU 等[14]研究發現，4A染色體標記 Xwmc491與穗粒數顯著關聯；MCINTYRE 等[15]在4A染色體上檢測到20個分子標記與穗粒數顯著關聯。迄今已在小麥21條染色體上發現穗粒數QTL，但4A染色體上穗粒數 QTL 的報道相對較少[16]。粒質量的遺傳力較高，是最穩定的產量構成要素[17]。MACCAFERRI 等[18]研究發現，4A 染色體標記 Xgwm1093 同時與株高、穗粒數、千粒質量等顯著關聯。目前，定位到的與粒質量有關的染色體區段也相對較多[9,15,19-25]。經濟系數反映生物產量轉化為經濟產量的效率，常常作為小麥高產育種的選擇指標，而關于小麥經濟系數QTL的研究只有零星的報道[26]。挖掘控制有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量和經濟系數的QTL及開發功能性分子標記，可為小麥產量性狀分子育種提供優異遺傳資源和選擇技術。

小麥病害是小麥生產中最重要的限制因素之一[27]。寧夏回族自治區屬于小麥條銹病流行區域，葉銹病也有加重的趨勢，白粉病已連續4 a成為該區小麥生產上的第一大病害[28-29]。小麥白粉病是由小麥禾布氏白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的真菌性病害，在病害發生的一般年份可使小麥減產5%～34%[30]。目前，國際上已正式命名了分布在小麥及其近緣種(屬)60個QTL位點的84個抗白粉病基因，這些抗性基因在不同時期不同程度地提高了小麥抗白粉病的能力[31-33]。小麥銹病分條銹病、稈銹病、葉銹病3種，危害部位以葉片為主，葉鞘、莖稈及穗部也可受害。流行年份受害小麥可減產30%以上，甚至絕收[34]。條銹病是由專性寄生條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌性病害，我國曾發生4次全國性條銹病大流行，1950年條銹病造成的損失最嚴重，使小麥減產60億kg[35]，已正式命名的小麥條銹病抗性基因有80個[36-37]；由葉銹菌(Pucciniareconditaf.sp.tritici)引起的小麥葉銹病也是小麥生產中主要的病害，已經發現的小麥抗葉銹病QTL(基因)有100多個，正式命名的基因有68個[38-39]。由于小麥白粉病菌、銹病菌具有群體大、適應范圍廣、生理小種變異快等特點，品種抗病性喪失嚴重[40-41]。寧夏回族自治區主栽小麥品種寧春4號適應性廣、穩產，但分蘗力低，對小麥主要病害抗性不強；而育成于山西省運城市的河東烏麥分蘗力強、穗粒數多、千粒質量高，高抗白粉病、中抗條銹和葉銹病等。前期對上述2個小麥品種遺傳性狀與分子標記進行了全面分析[42-43]。綜上，國內外關于小麥產量相關性狀與抗病性及其QTL的報道很多，但真正能夠應用于育種及生產上的優異材料和QTL亟待發掘。為此，對寧春4號與河東烏麥雜交后代F2群體進行產量相關性狀、抗病性及其QTL分析，發掘產量相關性狀表現優異、抗病性強的育種中間材料和QTL，以期為寧夏回族自治區小麥遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

寧春4號為寧夏回族自治區主栽小麥品種，河東烏麥由運城學院杜磊博士提供。2016年，在寧夏大學教學試驗農場對寧春4號與河東烏麥進行正反交，同年將收獲的雜交種子在云南省元謀縣南繁基地加代繁殖，2017年將收獲的種子種植于寧夏大學試驗農場，單粒點播，每行10粒，行長1.1 m，行寬0.2 m，獲得含331個單株的F2群體，其中，正交后代201株(編號001—007、013—206)，反交后代130株(編號008—012、207—331)。

1.2 小麥產量相關性狀的考察

成熟期，調查F2群體所有小麥單株的有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量，計算經濟系數。經濟系數=經濟產量/生物學產量，其中，生物學產量為收獲后未脫粒前的植株質量，經濟產量為脫粒后的籽粒質量。

1.3 小麥抗病性鑒定

種植寧夏回族自治區古老地方小麥品種紅禿子作為感白粉病、感銹病誘發圃，采用白粉菌混合小種(收集于寧夏回族自治區當地)、條銹菌和葉銹菌的混合小種(引自西北農林科技大學植物病理研究所)與馬鈴薯粉混合，接種于分蘗期小麥，之后覆膜并灌水，于次日上午揭膜，在小麥成株期對白粉病、條銹病、葉銹病抗性進行田間調查。成株期白粉病田間鑒定參照0～9級標準，其中，0級為免疫(I)， 0；級為近免疫(NI)，1～2級為高抗(HR)，3～4級為中抗(MR)，5～6級為中感(MS)，7～8級為高感(HS)，9級為極感(ES)[44]；銹病抗性鑒定采用0～5級標準，0、1、2、3、4、5級的抗病性分別為免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)、極感(ES)[45]。

1.4 小麥產量相關性狀和抗病性的分子標記分析

基因組DNA的提取采用SDS法[46]。前期根據小麥的7個部分同源群設計了SSR標記[42]，本研究利用能夠在寧春4號與河東烏麥間穩定擴增的49個SSR標記進行分析。其中，對本研究材料產量相關性狀和抗病性有明確QTL定位結果的13個標記的名稱及序列見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系和擴增程序參見王掌軍等[47]的方法，擴增產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經銀染后觀察、照相，并統計擴增條帶。

1.5 數據處理

采用Origin 8.0對產量相關性狀的頻率分布進行作圖；采用SPSS 20.0進行方差、相關性和聚類分析；采用Map Manager QTXb 20進行QTL定位，取P<0.05的LOD值作為判斷QTL存在的閾值，利用Kosambi函數中單標記回歸分析方法進行QTL分析，F2群體與母本相同的帶型記為B，與父本相同的帶型記為A，雜合帶型記為H，缺失帶型記為—。將331個F2單株的分子標記結果與產量相關性狀和抗病性數據相結合檢測相關QTL，QTL命名方法： q+目標性狀英文大寫字母縮寫+所在染色體，如在4A染色體上，與穗粒數相關的QTL位點命名為qKPS4A。

表1 分子標記序列信息Tab.1 Information of molecular marker sequences

2 結果與分析

2.1 寧春4號與河東烏麥雜交F2群體的產量相關性狀分析

2.1.1 產量相關性狀變異分析 對寧春4號與河東烏麥雜交F2群體的331個單株的產量相關性狀進行頻次分析(圖1)發現，各性狀在F2均出現較大分離，呈連續正態分布，為多基因控制的數量性狀，并且出現了許多具有超親性狀的單株。

對F2群體產量相關性狀進行分析(表2)發現，有效分蘗數和經濟系數的群體平均值均超過高親親本，穗粒數和穗粒質量的群體平均值均低于低親親本。其中，有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量、經濟系數的超中親比例分別達80.06%、34.14%、33.84%、78.55%，超高親比例分別達57.40%、34.14%、26.88%、75.23%。變異系數表現為穗粒質量(38.96%)>有效分蘗數(38.51%)>經濟系數(32.30%)>穗粒數(26.12%)。

2.1.2 基于產量相關性狀的聚類和相關性分析 基于有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量、經濟系數等指標對F2群體進行聚類分析，在遺傳距離為5 cM時，F2群體被分成8個類群(圖2)。其中，有效分蘗數表現為Ⅴ>Ⅷ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅶ，穗粒數表現為Ⅰ>Ⅵ>Ⅱ>Ⅴ>Ⅷ>Ⅲ>Ⅶ>Ⅳ，穗粒質量表現為Ⅰ>Ⅵ>Ⅱ>Ⅷ>Ⅴ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅶ，經濟系數表現為Ⅶ>Ⅰ>Ⅵ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅴ>Ⅷ>Ⅳ。綜上，類群Ⅰ的平均穗粒數最多(49.25粒)、穗粒質量最高(1.61 g)，類群Ⅴ的有效分蘗數最多(14.50個)，類群Ⅶ的經濟系數最高(0.46)。

對F2群體的4個產量相關性狀進行相關性分析(表3)發現，有效分蘗數與穗粒數(r為0.28)、穗粒質量(r為0.24)，穗粒數與穗粒質量(r為0.75)、經濟系數(r為0.21)，穗粒質量與經濟系數(r為0.38)均呈極顯著正相關；有效分蘗數與經濟系數(r為-0.25)呈極顯著負相關。

圖1 寧春4號與河東烏麥雜交F2產量相關性狀的頻率分布

性狀Trait寧春4號NingchunNo.4河東烏麥Hedongblack wheatF2變異范圍Variationrange平均值Mean標準差Standarddeviation變異系數/%Coefficientof variation超中親比例/%Proportion ofultra-mid parent超高親比例/%Proportion ofultra-high parent有效分蘗數/個Effective tillering num-ber2.496.312.00～17.007.052.7138.5180.0657.40穗粒數Kernel number per spike36.5136.499.50～56.3333.078.6426.1234.1434.14穗粒質量/gGrain weight per spike1.421.220.15～3.471.190.4638.9633.8426.88經濟系數Economic coefficient0.310.310.11～0.980.370.1232.3078.5575.23

圖2 寧春4號與河東烏麥雜交F2 8個類群的產量相關性狀Fig.2 Yield-related traits of 8 groups of F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

性狀 Trait有效分蘗數Effective tilleringnumber穗粒數Kernel number per spike穗粒質量Grain weight per spike穗粒數Kernel number per spike0.28**穗粒質量Grain weight per spike0.24**0.75**經濟系數Economic coefficient-0.25**0.21**0.38**

注：**表示相關性極顯著(P<0.01)。

Note: ** represents significant correlation (P<0.01).

2.2 寧春4號與河東烏麥雜交F2群體的抗病性鑒定

對寧春4號與河東烏麥雜交F2群體331個單株進行成株期白粉病、條銹病和葉銹病抗性鑒定(圖3)發現，在F2中分別有33(占9.97%)、3(占0.91%)、2(占0.60%)個單株表現為高抗白粉病(1～2級)、條銹病(1級)、葉銹病(1級)；分別有35(占10.57%)、51(占15.41%)、50(占15.11%)個單株表現為中抗白粉病(3～4級)、條銹病(2級)、葉銹病(2級)；分別有263(占79.46%)、277(占83.69%)、279(占84.29%)個單株表現為感白粉病(5～8級)、條銹病(3～4級)、葉銹病(3～4級)。其中，有50個(占15.11%)單株同時抗白粉病和條銹病，44個(占13.29%)單株同時抗白粉病和葉銹病，32個(占9.67%)單株同時抗條銹病和葉銹病，29個(占8.76%)單株同時抗白粉病、條銹病和葉銹病(表4)。

A、B、C分別為白粉病、條銹病、葉銹病

抗病類型Disease resistance type數量/株Number所占比例/% Proportion白粉病Powdery mildew6820.54條銹病Stripe rust5416.31葉銹病Leaf rust5215.71白粉病+條銹病Powdery mildew and stripe rust5015.11白粉病+葉銹病Powdery mildew and leaf rust4413.29條銹病+葉銹病Stripe rust and leaf rust329.67白粉病+條銹病+葉銹病Powdery mildew,stripe rust and leaf rust298.76

2.3 寧春4號與河東烏麥雜交F2群體的產量相關性狀和抗病性QTL定位

利用能夠在寧春4號與河東烏麥間穩定擴增的49個SSR標記對F2群體進行檢測(圖4)發現，其中，有13個標記對產量相關性狀和抗病性有明確的QTL定位結果(表5)。由表5可知，這13個標記共檢測到25個QTL，涉及2A、4A、5A、1B、2B、3B、5D、6D、7D等9條染色體，加性效應為-0.19～1.57，表型貢獻率為2%～9%，LOD值最大為23.40。其中，共檢測到4個有效分蘗數相關QTL，分布在5A、5D、6D染色體上，加性效應為0.09～0.91，表型貢獻率為3%～4%，LOD值最大為11.00；共檢測到5個穗粒數相關QTL，分布在4A、1B、5D、6D、7D染色體上，加性效應為-0.19～1.57，表型貢獻率為2%～6%，LOD值最大為15.00；共檢測到4個穗粒質量相關QTL，分布在4A、1B、2B、5D染色體上，加性效應為-0.01～0.12，表型貢獻率為3%～9%，LOD值最大為23.40；共檢測到2個經濟系數相關QTL，分布在3B、5D染色體上，加性效應分別為0.03、0.01，表型貢獻率均為3%，LOD值最大為7.00；共檢測到2個抗白粉病相關QTL，分布在5A、3B染色體上，加性效應分別為-0.15、-0.12，表型貢獻率均為2%， LOD值均為6.70；共檢測到5個抗條銹病相關QTL，分布在2A、5A、3B、5D染色體上，加性效應為-0.06～0.08，表型貢獻率為2%～4%， LOD值最大為10.20；共檢測到3個抗葉銹病相關QTL，分布在5A、3B、5D染色體上，加性效應為-0.11～0.01，表型貢獻率為2%～4%，LOD值最大為10.40。另外，5A染色體上檢測到有效分蘗數和抗白粉病、條銹病、葉銹病相關QTL，4A和1B染色體上均檢測到穗粒數和穗粒質量相關QTL，3B染色體上檢測到經濟系數和抗白粉病、條銹病、葉銹病相關QTL(圖5)，5D染色體上檢測到有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量、經濟系數和抗條銹病、葉銹病相關QTL，6D染色體上檢測到有效分蘗數和穗粒數相關QTL。這6條染色體存在產量相關性狀和抗病性相關QTL富集區，而4A、5A、1B、5D、6D染色體上分子標記數量非常少，不足以構建圖譜。

M：DL2000；P1：寧春4號；P2：河東烏麥；1—20：F2單株，其中，1—7、13—20為正交，8—12為反交

性狀Trait位點Locus標記位置Marker position標記名稱Marker nameLOD值LOD value表型貢獻率/%Phenotypic contribution rateP加性效應Additive effect顯性效應Dominant effect有效分蘗Effective tillering numberqET5A-2Chr5AXbarc207-5A8.6030.0130.370.74qET5A-1Chr5AXbarcM158-5A10.8040.0040.91-0.31qET5DChr5DXgpw4067-5D11.0040.0040.492.69qET6DChr6DXbarcM121-6D8.6030.0130.091.01穗粒數Kernel number per spikeqKPS4AChr4AXbarc106-4A7.5030.0230.023.12qKPS1BChr1BXbarc194-1B15.0060.0011.353.43qKPS5DChr5DXbarc320-5D14.2060.001-0.194.06qKPS6DChr6DXbarcM121-6D6.4030.0401.382.02qKPS7DChr7DXbarc121-7D6.1020.0481.571.44穗粒質量Grain weight per spikeqGWPS4AChr4AXbarc106-4A10.9040.004-0.010.20qGWPS1BChr1BXbarc194-1B23.4090.0000.120.18qGWPS2BChr2BXbarcM139-2B8.0030.0180.12-0.01qGWPS5DChr5DXbarc320-5D7.1030.0290.030.15經濟系數Economic coefficientqEC3BChr3BXbarc203-3B7.0030.0300.03-0.01qEC5DChr5DXbarc320-5D6.5030.0380.01-0.03白粉病Powdery mildewqPM5AChr5AXBARC207-5A6.7020.036-0.150.23qPM3BChr3BXbarc77-3B6.7020.036-0.120.31

續表5 寧春4號與河東烏麥雜交F2群體的產量相關性狀和抗病性QTL分析Tab.5(Continued) Analysis of QTLs for yield-related traits and disease resistance of F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

圖5 小麥產量相關性狀和抗病性QTL在3B染色體上的位置

3 結論與討論

小麥的最終產量是多個性狀共同作用的結果。小麥分蘗的發育及成穗情況嚴重影響其產量[48]；穗粒數和穗粒質量是與產量直接相關的穗部性狀，提高這2個性狀對產量的提升有明顯作用[13,49]；同時，經濟系數也是小麥高產的一個重要指標[50]。本研究發現，有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量和經濟系數在F2群體均呈連續正態分布，符合多基因控制的數量性狀遺傳特點。有效分蘗數和經濟系數的群體平均值分別為7.05個、0.37，均超過高親親本，超高親比例分別達57.40%、75.23%；穗粒數和穗粒質量的群體平均值分別為33.07粒、1.19 g，均低于低值親本，超中親比例分別達34.14%、33.84%，超高親比例分別達34.14%、26.88%。變異系數表現為穗粒質量(38.96%)>有效分蘗數(38.51%)>經濟系數(32.30%)>穗粒數(26.12%)。類群Ⅰ的平均穗粒數最多(49.25粒)、穗粒質量最高(1.61 g)，類群Ⅴ的有效分蘗數最多(14.50個)，類群Ⅶ的經濟系數最高(0.46)。有效分蘗數與穗粒數(r為0.28)、穗粒質量(r為0.24)，穗粒數與穗粒質量(r為0.75)、經濟系數(r為0.21)，穗粒質量與經濟系數(r為0.38)均呈極顯著正相關。

為了實現小麥高產、穩產和可持續發展，培育和推廣抗病品種被公認為安全、經濟、有效的方法[3]。在F2群體中分別鑒定出33、3、2個單株高抗白粉病、條銹病、葉銹病，35、51、50個單株中抗白粉病、條銹病、葉銹病，263、277、279個單株感白粉病、條銹病、葉銹病。50個單株同時抗白粉病和條銹病，44個同時抗白粉病和葉銹病，32個同時抗條銹病和葉銹病，29個同時抗3種病害。抗病性需要在發病充分的條件下，利用大群體進行多年多點鑒定，才能對資源的抗性做出科學、可靠的評價。本研究在相同發病條件下，利用混合生理小種對F2群體單株進行鑒定，評價了不同單株的抗病性，該結果具有一定參考價值，篩選的抗病單株也具有一定利用價值。但由于病原菌的變異，使得一些抗性基因失去了原有的抗性水平，今后還需進行單個生理小種的抗病性鑒定，以便明確材料所攜帶的抗性基因，為抗性基因的定位、克隆、功能驗證及其應用提供參考。

雖然小麥產量相關性狀和抗病性的QTL研究已有許多報道，但在育種上有利用價值的相關QTL有待進一步發掘。周淼平等[51]用近等基因系(RIL)群體在 5A 染色體上檢測到有效分蘗數相關的QTL；HUANG等[19]利用 BC2F2群體檢測到8個有效分蘗數相關QTL，分布于 1B、2A、2D、3B、4D、5D、6D、7A染色體上。本研究也在5A、5D、6D染色體上檢測到4個有效分蘗數相關QTL，加性效應為0.09～0.91，表型貢獻率為3%～4%，LOD值最大為11.00。目前，在小麥21條染色體上均發現穗粒數相關QTL[16]，定位到的與粒質量有關的QTL也較多[24-25]。本研究共檢測到5個穗粒數相關QTL，分布在4A、1B、5D、6D、7D染色體上，加性效應為-0.19～1.57，表型貢獻率為2%～6%，LOD值最大為15.00；共檢測到4個穗粒質量相關QTL，分布在4A、1B、2B、5D染色體上，加性效應為-0.01～0.12，表型貢獻率為3%～9%，LOD值最大為23.40。小麥經濟系數相關QTL報道非常少[26]。本研究共檢測到2個經濟系數相關QTL，分布在3B、5D染色體上，加性效應分別為0.03、0.01，表型貢獻率均為3%，LOD值最大為7.00。小麥抗病性QTL定位研究很多，但是不同遺傳背景下的QTL聚合到同一遺傳背景存在諸多困難[52-56]。共檢測到5個抗條銹病相關QTL，分布在2A、5A、3B、5D染色體上，加性效應為-0.06～0.08，表型貢獻率為2%～4%， LOD值最大為10.20；共檢測到3個抗葉銹病相關QTL，分布在5A、3B、5D染色體上，加性效應為-0.11～0.01，表型貢獻率為2%～4%，LOD值最大為10.40。另外，在5A染色體上檢測到有效分蘗數和抗白粉病、條銹病、葉銹病相關QTL，在4A和1B染色體上均檢測到穗粒數和穗粒質量相關QTL，在3B染色體上檢測到經濟系數和抗白粉病、條銹病、葉銹病相關QTL，在5D染色體上檢測到有效分蘗數、穗粒數、穗粒質量、經濟系數和抗條銹病、葉銹病相關QTL，在6D染色體上檢測到有效分蘗數和穗粒數相關QTL。這6條染色體存在不同性狀QTL富集區。通過大量文獻可知，因群體、標記、背景等不同，檢測出來的QTL數量和位置也不盡相同。今后，需通過開發高效的分子標記構建密度較飽和的物理圖譜，進而使與產量相關性狀和抗病性相關的QTL(尤其是主效QTL)得以精細定位，為寧夏回族自治區小麥遺傳改良提供理論依據。