Triple-TOF-MS/MS法檢測植物油中甘油三酯

邢常瑞，袁翔宇，章 鋮，鞠興榮，袁 建，何 榮

(1.南京財經大學 食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量 安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023； 2.安徽糧食工程職業學院，合肥 523147)

天然植物油中含有復雜的甘油三酯組分，其在植物油中的含量高達95%～98%[1]。組成甘油三酯的脂肪酸種類及其在甘油骨架上的位置決定了甘油三酯特殊營養價值，因此研究甘油三酯的組成具有十分重要的意義。

目前，檢測甘油三酯常用的方法主要有高溫氣相色譜法、高效液相色譜法等，其中高效液相色譜法尤其是反相高效液相色譜法的應用最為普遍。檢測器有紫外、示差折光[2]、蒸發光散射[3]等常用來識別和表征甘油三酯，但是只能對有標準品且保留時間不同的甘油三酯進行定性定量區分、測定，對于碳原子當量(ECN)相同即保留時間相同的甘油三酯則無法鑒別。蒸發光散射檢測器(ELSD)僅能對植物油中的甘油三酯進行初步的定性，確定基本的ECN輪廓。高分辨質譜(Triple-TOF-MS/MS)可進行未知物的探索，對沒有標準品的物質也能根據其母離子及碎片離子推測其結構。

本文在高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)法分析以ECN計的芝麻油、菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油的甘油三酯組成與含量的基礎上，采用高分辨質譜對6種食用植物油中的甘油三酯進行測定，并確定每種ECN下的甘油三酯組成與含量，建立一種分析測定食用植物油中甘油三酯組成與結構的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芝麻油(采集自安徽主產區，3個)、菜籽油(采集自湖南主產區，包括1個低芥酸菜籽油和2個高芥酸菜籽油)、大豆油(采集自東北三省，3個)、花生油(市場選購，3個)、葵花籽油(市場選購，3個)和玉米油(市場選購，3個)；0.22 μm尼龍微孔濾膜(天津津騰公司)，乙腈(德國Merck公司，色譜級)，異丙醇(德國Merck公司，色譜級)。

BSA223S-CW電子天平；SB25-12DTDN超聲波清洗器；Dionex Utimate3000液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Alltech3300蒸發光散射檢測器(美國Grace公司)；Triple-TOF-MS/MS(美國AB Sciex公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的前處理

稱取50 mg的植物油樣溶解于乙腈-異丙醇(體積比1∶1)中[4]，并定容至10 mL容量瓶中，經0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾后，置于2 mL進樣瓶中，分別進行HPLC-ELSD檢測和Triple-TOF-MS/MS檢測。在進行Triple-TOF-MS/MS檢測前，需要對過膜的樣品稀釋1 000倍。

1.2.2 HPLC-ELSD檢測條件

色譜柱為Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相為乙腈和異丙醇，進行梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL。ELSD參數：漂移管溫度50℃，載氣流速1.8 L/min，增益為1[5]。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.2.3 Triple-TOF-MS/MS檢測條件

HPLC條件：色譜柱為Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相為乙腈-水(體積比19∶1)和異丙醇，其中在乙腈-水中添加5 mmol/L乙酸銨[6]，進行梯度洗脫，洗脫程序見表2；流速0.6 mL/min；柱溫30℃；進樣量5 μL。

Triple-TOF-MS/MS條件：ESI正離子源，TOF-MS采集積累時間0.25 s，采集范圍(m/z)100～1 200，離子源溫度500℃，電噴霧電壓5 000 V，霧化氣壓力310.26 kPa，輔助氣壓力344.75 kPa，氣簾氣壓力241.32 kPa，碰撞氣體為氮氣，去簇電壓80 V，碰撞能量35 V[7]。

表2 Triple-TOF-MS/MS梯度洗脫程序

1.2.4 甘油三酯定性分析

根據AOCS標準中大豆油甘油三酯標準色譜圖進行比對，再結合甘油三酯在高效液相色譜中的出峰規律，即碳原子當量數(ECN)越大，保留時間越長，確定各個色譜峰對應的甘油三酯的ECN。

Triple-TOF-MS/MS根據甘油三酯分子中碳鏈在質譜中斷裂規律，結合在質譜中獲得一級質譜母離子(加氫母離子、加鈉離子和加氨母離子)相對分子質量以及二級質譜的碎片離子([DAG]+)對各甘油三酯進行定性。

1.2.5 甘油三酯定量分析

利用面積歸一化法計算各甘油三酯的相對含量，即甘油三酯相對含量=各甘油三酯峰面積/總峰面積×100%。

2 結果與討論

2.1 HPLC-ELSD檢測食用植物油甘油三酯組成

按照1.2.2高效液相色譜條件對食用植物油樣品進行色譜分離，根據1.2.4初步定性后采用面積歸一化法測定不同ECN下的甘油三酯相對含量，結果見表3。

表3 HPLC-ELSD測定的植物油不同ECN下甘油三酯相對含量

由表3可知，6種植物油的甘油三酯多集中在ECN為42～48之間。高芥酸菜籽油與低芥酸菜籽油不同ECN下的甘油三酯含量有很大差別，高芥酸菜籽油的甘油三酯組成更復雜，其中ECN為50以上的甘油三酯含量明顯高于低芥酸菜籽油和其他5種植物油，花生油中C20以上的飽和脂肪酸如花生酸、山崳酸、木焦油酸的含量都遠高于其他5種植物油，因此花生油ECN為50的甘油三酯含量也較高。芝麻油與葵花籽油和玉米油在脂肪酸組成上較為相似，其ECN甘油三酯的組成與含量差異也不大。但是在同一保留時間的色譜峰包括多種具有相同ECN的不同種類的甘油三酯，HPLC-ELSD無法確定各個色譜峰相對應的甘油三酯，僅能對甘油三酯的ECN輪廓進行初步鑒定。

2.2 Triple-TOF-MS/MS檢測食用植物油甘油三酯組成

按照1.2.3 HPLC條件進行分離后，采用Triple-TOF-MS/MS條件對食用植物油樣品進行質譜分析，以相對分子質量為875的質譜離子的二級質譜圖分析為例，如圖1所示。首先，可以找到其準離子分子峰874.771 2m/z，在二級質譜中，可以找明顯的碎片離子[DAG]+857.746 5m/z，與[DAG]+874.771 2m/z相比離子質量約減少了17m/z，表明失去了一個羥基；碎片離子[DAG]+601.510 0m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質量約減少了256m/z，表明失去了一個棕櫚酸(P)分子；碎片離子[DAG]+575.494 8m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質量約減少了282m/z，表明失去了一個油酸(O)分子；碎片離子[DAG]+577.509 8m/z，與[DAG]+857.746 5m/z相比離子質量約減少了280m/z，表明失去了一個亞油酸(L)分子。

圖1 相對分子質量為875的質譜離子的二級質譜圖

根據脂肪酸在甘油骨架上分布的情況，酰化在Sn-1、Sn-3位的脂肪酸要比酰化在Sn-2位上的脂肪酸更容易斷裂，因而從甘油骨架斷裂一個Sn-1、Sn-3位脂肪酸形成的1,2-二酰基甘油離子或2,3-二酰基甘油離子的豐度高于從Sn-2位斷裂一個脂肪酸形成1,3-二酰基甘油離子的豐度[8]。碎片離子[DAG]+577.509 8m/z的強度略低于[DAG]+575.494 8m/z和[DAG]+601.510 0m/z，因此推測該甘油三酯可能為PLO(忽略Sn-1、Sn-3位置異構)。同理，由此對菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油甘油三酯進行鑒定，共得到35種甘油三酯，根據質譜母離子及碎片離子可進行定性，用面積歸一化法得到其相對含量。芝麻油、菜籽油、大豆油等食用植物油的甘油三酯組成與含量見表4和表5。

從表4和表5可知，Triple-TOF-MS/MS可準確地確定相同ECN的不同甘油三酯的種類。6類植物油均含有LnLL、LLO、LOO、LLL、PLO、PLL和OOO 7種甘油三酯。在芝麻油中，共找到15種甘油三酯，其中只含有油酸和亞油酸的甘油三酯最多，占總甘油三酯含量的60%以上；在菜籽油中含量最多的甘油三酯分別是OOO、LOO和PLL。其中，高芥酸菜籽油中共有21種甘油三酯，是6種植物油中鑒定出最多的。此外在高芥酸菜籽油中還檢測到很多含有芥酸的甘油三酯，如ELnP、AoLnE、ELE、EOE等。而在低芥酸菜籽油中，檢測到17種甘油三酯；LLO、LOO和PLO是花生油中含量最高的3種甘油三酯，超過總含量的50%；大豆油中主要是LLL、LLO和PLL 3種甘油三酯，占總甘油三酯的46%以上；在葵花籽油和玉米油中都鑒定出15種甘油三酯，LLL、LLO和PLL含量最多的3種甘油三酯，同樣表明葵花籽油和玉米油不僅在脂肪酸組成和含量上具有相似性，在甘油三酯上組成與含量上也高度統一。

表4 Triple-TOF-MS/MS測定的食用植物油甘油三酯組成及相對含量

注：“-”表示未檢出；P.棕櫚酸；S.硬脂酸；O.油酸；L.亞油酸；Ln.亞麻酸；A.花生酸；Ao.花生一烯酸；B.山崳酸；E.芥酸；Li.木焦油酸。甘油三酯Sn-1、Sn-3位置異構未考慮。下同。

表5 Triple-TOF-MS/MS測定的食用植物油甘油三酯組成及相對含量

3 結 論

本文研究發現，常規的HPLC-ELSD法僅能對甘油三酯的碳原子當量數(ECN)輪廓進行初步鑒定，而Triple-TOF-MS/MS能夠根據一級質譜母離子(加氫母離子、加鈉離子和加氨母離子)相對分子質量以及二級質譜的碎片離子([DAG]+)對相同ECN的甘油三酯進行定性分析，采用該方法檢測芝麻油、葵花籽油、大豆油、菜籽油、花生油和玉米油，共獲得35種甘油三酯。其中6種植物油中均含有LnLL、LLL、LLO、PLL、LOO、PLO和OOO 7種甘油三酯。將Triple-TOF-MS/MS法應用于油脂中甘油三酯的檢測，可為我國糧油品質控制及分析提供理論基礎。