棉籽及棉籽相關產品中黃曲霉毒素B1含量的測定及遷移規律分析

楊偉國，錢建瑞，袁 瑞，孟祥國，宋建峰

(1.晨光生物科技集團股份有限公司，河北 邯鄲 057250； 2.河北晨光檢測技術服務有限公司，河北 邯鄲 057250)

黃曲霉毒素是由真菌黃曲霉和寄生曲霉產生的一組強的次生代謝產物，尤其是黃曲霉毒素B1，是目前發現的真菌類中毒性最大、污染范圍最廣的毒素之一[1]。近年來黃曲霉毒素污染事件的發生，已引起世界各國及消費者對食品安全的關注[2-3]。黃曲霉毒素的檢測方法主要包括薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)(液液提取和固相提取)、微柱篩選法、酶聯免疫吸附法(ELISA)[4-7]。高效液相色譜法測定黃曲霉毒素是目前國際上普遍采用的定量和確認的分析方法，但用于棉籽及棉籽相關產品中黃曲霉毒素的研究鮮見報道。

我國是棉花種植大國，棉籽作為棉花加工的副產物來源豐富。棉籽中含有油脂和蛋白，是重要的油料及飼料原料[8]。棉籽相關產品主要包括棉殼、棉籽蛋白和棉籽油。棉殼主要用于菌類培養及牛羊等飼養用原料；棉籽蛋白作為單一飼料，應用于整個飼料行業；棉籽油作為食用植物油，直接面對終端市場。

棉籽在采摘、晾曬、貯藏、運輸、加工等過程中，由于環境條件及水分控制等問題，極易引起霉變及霉菌毒素污染[9-10]，因而棉殼、棉籽蛋白、棉籽油中極有可能由于加工過程中的毒素遷移而被污染。GB 2761—2017《 食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》和 GB 13078—2017《飼料衛生標準》分別對棉籽油、棉籽相關產品黃曲霉毒素B1做了限定。本文采用GB/T 30955—2014《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》并優化其前處理方法，對棉籽及其相關產品的黃曲霉毒素B1進行測定。 通過優化后的方法，開展棉籽相關產品加工過程中黃曲霉毒素的監測與控制研究，明確黃曲霉毒素B1在棉籽加工過程中的含量變化、遷移規律，為開發黃曲霉毒素控制技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

棉籽，產地A、B。棉籽蛋白：棉籽經剝殼、壓坯、提油后的黃色粉末。棉籽油：棉籽經剝殼、壓坯、提取、濃縮、堿煉后的淺黃色液體。以上樣品均由晨光生物科技集團股份有限公司提供。

黃曲霉毒素B1標準品(純度>99%)，美國Sigma公司；甲醇、乙腈，色譜純，美國Fisher公司；磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、碘、濃鹽酸，分析純；氯化鉀，優級純；實驗室用水均為Milli-Q超純水。

1.1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀(配熒光檢測器)，美國Agilent公司；柱后衍生系統，美國Pickering Laboratories公司；島津分析天平；免疫親和柱(黃曲霉毒素B1)，北京華安麥科生物技術有限公司；玻璃纖維濾紙(直徑110 mm，孔徑1.5 μm)，英國GE Healthcare公司；Master-S UVF超純水機，上海和泰儀器有限公司；0.22 μm針式過濾膜，上海安譜科學儀器有限公司；調速多用振蕩器，江蘇金壇市中大儀器廠；數控超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 使用溶液及標準溶液制備

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：稱取7.9 g氯化鈉、1.8 g磷酸氫二鉀、0.24 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，900 mL水溶解，然后用濃鹽酸調節pH至7.0，最后用水稀釋至1 000 mL，保存于4℃備用。

10%甲醇-PBS：取10 mL甲醇，加入PBS并定容至100 mL。

黃曲霉毒素B1標準儲備溶液：將黃曲霉素B1標準品用甲醇配制成13 μg/kg的標準儲備溶液，保存于4℃備用。

柱后衍生溶液：稱取0.5 g碘，溶解于100 mL甲醇后，加純水定容至1 000 mL，以0.45 μm的尼龍濾膜過濾，充入氮氣避光保存。

1.2.2 色譜分離條件

ODS C18 色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；進樣量100 μL；柱溫40℃；流動相為乙腈-甲醇-水(體積比22∶22∶56)溶液；流速1.0 mL/min；激發波長360 nm，發射波長440 nm。

1.2.3 柱后衍生化條件

衍生溶液為體積分數10%甲醇溶液(含0.05%碘)；泵洗液為體積分數20%甲醇溶液；衍生溶液流速0.3 mL/min；衍生反應溫度95℃。

1.2.4 樣品預處理

1.2.4.1 提取

棉籽蛋白樣品混勻后用高速粉碎機粉碎，過0.25 mm分析篩。棉籽樣品混勻后用高速粉碎機粉碎，過2 mm孔徑試驗篩。稱取5 g樣品，加一定量溶劑,采用一定的方式提取，用普通濾紙進行過濾，收集濾液至250 mL玻璃錐形瓶中；移取5 mL濾液至50 mL容量瓶中，用PBS定容；將稀釋液用玻璃纖維濾紙過濾至三角瓶中。

1.2.4.2 凈化

取1.2.4.1稀釋液10 mL，加入免疫親和柱(流速1 mL/min)；液體徹底排凈后，加入5 mL 10%甲醇-PBS(或純水)洗滌2次(流速3 mL/min)；棄去洗脫液，加入1 mL甲醇，孵育2 min(流速1 mL/min)；收集洗脫液，搖勻。

1.2.5 樣品測定

將1.2.4.2洗脫液過0.45 μm有機濾膜，進行高效液相色譜分析。每次進樣100 μL，重復2次，記錄色譜峰面積，利用標準曲線(y=321.91x+1.234,R2=0.999 9)計算樣品中黃曲霉毒素B1含量。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優化

2.1.1 提取方式優化

以不同提取方式為探究因素，利用高效液相色譜對同一產地、同一批次的棉籽蛋白進行黃曲霉毒素B1含量的測定，結果見表1。

由表1可以看出，不同提取方式對棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1的檢測結果有較大的影響。其中超聲30 min提取方式得出的黃曲霉素毒素B1含量值最高，故確定最優提取方式為超聲30 min。

表1 不同提取方式下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

2.1.2 提取溶劑優化

根據相關文獻資料可知，黃曲霉毒素B1萃取溶劑較多，有80%甲醇溶液、85%丙酮溶液和86%乙腈溶液等。以不同提取溶劑為探究因素，利用高效液相色譜對同一產地、同一批次的棉籽蛋白進行黃曲霉毒素B1含量的測定，結果見表2。

表2 不同提取溶劑下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

由表2可以看出，不同的提取溶劑對棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1檢測結果有很大的影響。其中，提取溶劑為86%乙腈溶液的檢測結果分別為80%甲醇溶液檢測結果的2.81倍，85%丙酮溶液檢測結果的1.57倍。由此可知，86%乙腈溶液提取效果最好，而80%甲醇溶液提取效果遠弱于其他兩種溶劑，故確定最優提取溶劑為86%乙腈溶液。

2.1.3 固液比優化

固液比不同，樣品提取過程中的浸潤狀態不同，最終黃曲霉毒素B1檢測結果也會有很大不同。以不同固液比為探究因素，利用高效液相色譜對同一產地、同一批次的棉籽蛋白進行黃曲霉毒素B1含量的測定，結果見表3。

表3 不同固液比下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

由表3可以看出，固液比1∶20提取效果高于固液比1∶5和1∶10。繼續增大固液比提取可能會更充分，但考慮溶劑成本及毒性因素，確定最優固液比為1∶10。

2.1.4 超聲時間優化

超聲時間不同，樣品與提取溶劑作用時間不同，從而導致黃曲霉毒素B1的提取效率不同。以不同超聲時間為優化因素，利用高效液相色譜對同一產地、同一批次的棉籽蛋白進行黃曲霉毒素B1含量的測定，結果見表4。

由表4可以看出，黃曲霉毒素B1檢測結果隨超聲時間的延長而增大，但增大幅度較小。因此，在滿足實際檢測需要下，考慮檢測時效性，確定最優超聲時間為10 min。

2.2 方法穩定性和準確性驗證

針對2.1探究確定的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1提取方法進行重復性驗證，以證明新方法具有實際檢測應用性。取批號為1805002M的棉籽蛋白，按照2.1提取條件進行日內和日間重復性驗證，結果見表5。選取棉籽蛋白和棉籽油2種已知結果的產品，加入適當濃度的標樣，測定加標回收率，結果見表6。

表4 不同超聲時間下棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量

表5 方法穩定性驗證

表6 方法準確性驗證

由表5和表6可以看出，本文2.1建立的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1提取方法，檢測重復性較好，日內精密度在1.82%～4.41%之間，日間精密度為6.00%，樣品加標回收率在97%～108%之間，可滿足日常實際檢測及質量控制需求。

2.3 棉籽及棉籽相關產品中黃曲霉毒素B1的遷移規律

對A地區及B地區多批次棉籽樣品進行仁殼分離，并利用本文建立的測定方法分別對棉籽及其相關產品的黃曲霉毒素B1含量進行檢測，結果見表7。

表7 不同來源棉籽及棉籽相關產品中 黃曲霉毒素B1含量 μg/kg

由表7可以看出，不同來源的棉籽中黃曲霉毒素B1含量差異較大，A地區棉籽中黃曲霉毒素B1含量較低，B地區棉籽中黃曲霉毒素B1含量偏高。不同來源棉籽仁殼分離后的黃曲霉毒素B1主要集中在棉仁中。A地區和B地區棉仁生產的棉籽油中均未檢出黃曲霉毒素B1(<1 μg/kg示為未檢出，下同)，A地區的棉籽蛋白中未檢出黃曲霉毒素B1，而B地區的棉籽蛋白中黃曲霉毒素B1含量在12.0～99.1 μg/kg。

根據表7，A地區棉籽中未檢測出黃曲霉毒素B1，棉殼和棉仁中也均未檢出。B地區棉籽中均檢測出黃曲霉毒素B1，且黃曲霉毒素B1含量差異較大，但在棉殼中均未檢出黃曲霉毒素B1，除2個樣品外，其余樣品對應棉仁中黃曲霉毒素B1的檢測值為棉籽中的1.76～2.46倍。B地區棉籽中均檢測出黃曲霉毒素B1，但仁殼分離后的棉殼和部分棉仁中未檢出。這可能是因為黃曲霉毒素在棉籽中分布非常不均勻，取樣混樣階段無法完全消除不勻等因素，很難保證同一批次棉籽黃曲霉毒素含量在同一個水平上。由此可以確定黃曲霉毒素B1在B地區棉籽中主要分布在棉仁中。

經分析，B地區棉籽成熟期正值夏秋季，溫濕度均適宜，導致容易感染黃曲霉，產生黃曲霉毒素。有關研究介紹，黃曲霉一旦在果仁上繁殖，由于果仁的蛋白質等豐富營養條件可迅速產生黃曲霉毒素，而其他部位如棉殼等則不易產生。而A地區屬溫帶大陸性氣候，具有夏季干熱、冬季干冷的特點，且光線充足，太陽輻射總量全年為5 000～6 490 MJ/m2，紫外線較強不適宜黃曲霉的生長及毒素的產生，故A地區產棉籽在生長期間是很少有黃曲霉及毒素產生的。

B地區棉籽加工的棉籽蛋白中均可檢測出黃曲霉毒素B1，但棉籽油中均未檢測出。經分析，黃曲霉毒素易溶于醇類溶劑，棉籽蛋白是由棉仁經過預處理、浸出、粉碎后得到的產品，由于棉仁中含有黃曲霉毒素B1，故在生產中易富集于棉籽蛋白中。而棉籽油是棉仁經過浸出、精煉后得到的產品，可能一方面是遷移量較少，一方面堿煉和水洗過程中能夠去除大部分黃曲霉毒素B1，故未檢測出黃曲霉毒素B1。由此可見，從棉籽原料生產至棉籽蛋白和棉籽油的過程中，黃曲霉毒素B1主要遷移至棉籽蛋白中。

3 結 論

本文建立了棉籽及棉籽相關產品中黃曲霉毒素B1的測定方法。將樣品混合均勻粉碎，稱樣量5 g，提取溶劑為86%乙腈溶液，固液比1∶10，超聲提取10 min，提取液經免疫親和柱凈化，再進行高效液相色譜分析。經日內和日間重復性驗證可知該方法完全可滿足日常實際質量控制需求。

不同產地的棉籽因氣候因素影響，受黃曲霉毒素污染的水平差異較大。棉籽中棉仁是黃曲霉毒素的主要分布位置。受黃曲霉毒素污染的棉籽在加工過程中，黃曲霉毒素B1會由棉籽中遷移至棉仁中再遷移至棉籽蛋白中，而棉殼、棉籽油幾乎不會受到污染。因此，為防止棉籽蛋白產品中黃曲霉毒素超標，應加強對棉籽原料的檢測和控制，已經被污染的原料，可在加工過程中通過黃曲霉毒素脫除技術進行脫除，確保棉籽蛋白產品的黃曲霉毒素B1含量符合國標要求。