南瓜籽甾醇對SD大鼠體內抗氧化作用的影響

張 宇，孫 波，趙 曉，馬藝熒，郝 宇，解雙瑜，李天一

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

南瓜籽甾醇是南瓜籽中重要的生物活性物質，占南瓜籽油含量的0.3%左右[1]。近年來，植物甾醇因其具有抗炎、降膽固醇以及抗癌等生理功能而受到廣泛關注[2-4]，抗氧化性也是其研究的主要熱點之一。植物甾醇的抗氧化作用主要是因為其側鏈上存在亞乙基，具有不受阻的烯丙基氫原子，可以通過促進氫原子的釋放，使所得自由基異構化為更為穩定的叔自由基，進而中斷氧化反應[5]。

研究發現，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病等在內的人體各種疾病的發生都與其體內抗氧化體系失衡有關[6-8]，即當機體處于氧化應激狀態，過量的自由基會與脂質、蛋白質等生物大分子作用，改變其功能性，導致細胞膜結合受體以及相關酶的失活，損害細胞正常功能，造成細胞壞死、組織退化、衰老以及其他氧化應激相關疾病的發生[9-10]。而一些外源性抗氧化劑的攝入，有助于降低體內自由基水平，在一定程度上預防和修復自由基引起的氧化損傷，增強正常細胞對氧化應激的抵抗能力[11]，進而對各種疾病起到預防的作用[12]。

體內抗氧化的常用評價指標有谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)等。其中GSH-Px和SOD是生物體內清除自由基的重要酶類，T-AOC是生物體整體抗氧化能力的評價指標，其活性及水平越高，表明機體抗氧化能力越強。MDA則是生物體內脂質過氧化損傷產物之一，其含量越低，機體抗氧化能力越強。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是生物體內DNA受自由基攻擊后的標志性氧化損傷產物[13]，其含量越高表明機體氧化損傷程度越嚴重，且有研究發現8-OHdG與氧化應激相關的多種疾病的發生發展存在密切關系[14-15]。

因此，選擇上述5個指標作為體內抗氧化評價指標研究南瓜籽甾醇對SD大鼠體內的抗氧化作用，進而對南瓜籽甾醇體內抗氧化能力進行綜合評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性SD大鼠(清潔級)40只，體重(150±10)g，由黑龍江省醫學實驗動物供應基地提供。南瓜籽，由黑龍江省雙鴨山市寶清縣提供。

總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。考馬斯亮藍G250，合肥博美生物技術有限責任公司；氫氧化鈉，天津市大陸化學試劑廠；磷酸、正己烷，天津市富宇精細化工有限公司；冰醋酸，上海超聰化工有限公司；無水乙醇，天津市天利化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

CZR 309型榨油機，廣州萬彪通用設備有限公司；Tecan Infinite M200酶標儀，瑞士帝肯(TECAN)集團公司；Sigma 3-18K低溫高速離心機，德國Sigma公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；FA 2004型電子天平，上海橫平儀器儀表廠；DPH-9162 電熱恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；XW-80A 旋渦混合器，上海弛唐電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜籽甾醇的提取

室溫下利用CZR 309型榨油機榨取南瓜籽油，5 000 r/min離心10 min，取上層清油與1 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液以體積比1∶5混合，煮沸回流60 min后，減壓蒸餾回收乙醇。余下的皂化液冷卻至室溫，利用等體積正己烷萃取2次，合并上層萃取液并用蒸餾水洗滌至中性，常溫條件下減壓蒸餾回收正己烷，得南瓜籽甾醇粗制品。

取一定量的南瓜籽甾醇粗制品，加入無水乙醇，在熱水浴中回流至其完全溶解后，緩慢冷卻至室溫。在4℃條件下冷卻結晶，過濾并干燥得到精制南瓜籽甾醇，用以進行體內抗氧化能力的研究。

1.2.2 實驗動物分組及灌胃飼養方式

將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為空白對照組、低劑量甾醇組、中劑量甾醇組和高劑量甾醇組。SD大鼠適應性飼養7 d后，以灌胃方式給藥。根據FDA推薦的人體甾醇適宜攝入量[16]，設置SD大鼠南瓜籽甾醇灌胃的低、中、高劑量分別為80、160 mg/(kg·d)和320 mg/(kg·d)。飼養期間，SD大鼠自由攝食和飲水。

1.2.3 SD大鼠體內生化指標的檢測

在SD大鼠飼養灌胃期間，每7 d稱量一次SD大鼠的體重，35 d后脫頸處死全部SD大鼠，摘取其眼球取全血，采血過程應注意清潔以避免紅細胞溶血。將取出的全血于室溫下平衡1～2 h后，4℃條件下8 000 r/min離心10 min，取上清液進行T-AOC水平、SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量以及8-OHdG含量的測定。其中SOD活性的測定采用羥胺法檢測，GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法檢測，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測，8-OHdG含量采用競爭法檢測。

摘取SD大鼠的肝臟，用冷藏的生理鹽水漂洗以除去肝臟表面血跡以及毛發等，用濾紙吸干表面水分。將肝臟與生理鹽水以質量體積比1∶9的比例混合，置于勻漿器中，在冰水浴條件下勻漿。隨后4℃條件下8 000 r/min離心10 min，分離上清液得SD大鼠肝臟組織勻漿，用以進行T-AOC水平、SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量以及組織蛋白含量的測定。組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[17]。

1.2.4 統計分析

利用SPSS Statistics 21.0對數據進行統計分析，結果以“平均值±標準差”的形式表示，圖表中字母表示差異性顯著的分析結果。

2 結果與分析

2.1 南瓜籽甾醇對SD大鼠體重的影響(見表1)

由表1可知，隨著喂養時間的延長，各組SD大鼠的體重均上升，灌胃飼養35 d后，4組SD大鼠體重增加量分別為172.2、173.9、172.9、183.7 g，各組體重之間差異不顯著。同時在喂養期間，各組SD大鼠均活潑好動，攝食飲水正常，毛皮順滑有光澤，可以初步表明喂食南瓜籽甾醇對SD大鼠的體重無不良影響。

表1 不同劑量南瓜籽甾醇對SD大鼠體重的影響

2.2 南瓜籽甾醇對SD大鼠血清和肝臟中T-AOC水平的影響(見表2)

表2 不同劑量南瓜籽甾醇對SD大鼠血清和肝臟中 T-AOC水平的影響

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

由表2可知，與空白對照組相比，低、中、高劑量甾醇組SD大鼠的血清和肝臟中T-AOC水平均呈現不同程度的提高，并且在灌胃劑量范圍內，這種提高具有一定的劑量依賴性。表明南瓜籽甾醇能夠提高SD大鼠血清和肝臟中T-AOC水平。

2.3 南瓜籽甾醇對SD大鼠血清和肝臟中SOD活性的影響(見表3)

表3 不同劑量南瓜籽甾醇對SD大鼠血清 和肝臟中SOD活性的影響

由表3可知，與空白對照組相比，低、中、高劑量甾醇組的SD大鼠血清和肝臟中SOD活性顯著升高(p<0.05)。這說明南瓜籽甾醇在一定劑量時能夠提高SD大鼠血清和肝臟中的SOD活性，具有清除SD大鼠體內產生的氧自由基的作用。

2.4 南瓜籽甾醇對SD大鼠血清和肝臟中GSH-Px活性的影響(見表4)

由表4可知，與空白對照組相比，低、中、高劑量甾醇組SD大鼠血清和肝臟中GSH-Px活性顯著升高(p<0.05)，且在灌胃劑量范圍內，這種作用呈現一定的劑量依賴性。表明南瓜籽甾醇具有增強SD大鼠體內GSH-Px活性，具有分解生成的過氧化物的作用。

表4 不同劑量南瓜籽甾醇對SD大鼠血清 和肝臟中GSH-Px活性的影響

2.5 南瓜籽甾醇對SD大鼠血清和肝臟中MDA含量的影響(見表5)

表5 不同劑量南瓜籽甾醇對SD大鼠血清 和肝臟中MDA含量的影響

由表5可知，與空白對照組相比，灌胃南瓜籽甾醇的實驗組SD大鼠血清和肝臟中MDA含量均降低，且隨著灌胃劑量的增加，降低幅度越顯著。說明南瓜籽甾醇對SD大鼠體內的脂質過氧化反應具有一定的抑制作用，并且這種作用與南瓜籽甾醇劑量之間呈現正相關關系。

2.6 南瓜籽甾醇對大鼠血清中8-OHdG含量的影響(見表6)

組織中8-OHdG含量的測定需要DNA的提取及相關酶消化等步驟，這些過程很容易發生人工誘導氧化反應，導致最終測定結果偏高[18]，因此在實驗過程中僅選擇SD大鼠血清作為實驗對象。由表6可知，與空白對照組相比，灌胃南瓜籽甾醇的實驗組SD大鼠血清中8-OHdG含量顯著降低(p<0.05)，說明南瓜籽甾醇可以在一定程度上抑制SD大鼠的DNA氧化損傷，且南瓜籽甾醇灌胃劑量越高，這種作用越顯著。

表6 不同劑量南瓜籽甾醇對大鼠血清中 8-OHdG含量的影響

3 結 論

南瓜籽甾醇對SD大鼠體內抗氧化能力的增強具有一定的促進作用，并且這種作用在一定程度上存在劑量依賴性。這可能是因為南瓜籽甾醇可以通過直接與SD大鼠體內酶和非酶系統產生的自由基反應，或促進SD大鼠血清及肝臟中相關抗氧化酶的活性，進而與產生的自由基作用，避免其對生物膜中脂質、蛋白質以及核酸等生物大分子的攻擊，抑制脂質過氧化物的生成，以達到抗氧化作用的目的。