氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定魚(yú)油保健品中的EPA和DHA含量

朱麗君，王魯霞，武 玲，趙寶義，范美霞，姜祎頔

(1.菏澤市行政審批服務(wù)局，山東 菏澤 274000; 2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000)

二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是深海魚(yú)油中的特征脂肪酸，屬Ω-3多不飽和脂肪酸，是人體重要的營(yíng)養(yǎng)成分?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA不僅具有抑制血小板凝聚、舒張血管、調(diào)節(jié)血脂、健腦明目、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)嬰兒視網(wǎng)膜發(fā)育等功能，可以防治心腦血管疾病、炎癥、腎病等[1-4]，而且其具有通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲[5]從而防治癌癥的功效，因此魚(yú)油產(chǎn)品為專家所推崇。目前，高品質(zhì)或經(jīng)深加工的魚(yú)油主要用于食品、保健品以及藥品[6]，其中以保健品最多。當(dāng)前市場(chǎng)上魚(yú)油保健品質(zhì)量參差不齊[7]，普通魚(yú)油類產(chǎn)品中EPA和DHA的含量遠(yuǎn)遜于深海魚(yú)油類產(chǎn)品[8]，容易誤導(dǎo)消費(fèi)者。因此，檢測(cè)魚(yú)油保健品中EPA和DHA的含量成為辨別其質(zhì)量的重要方法。針對(duì)國(guó)標(biāo)GB 5009.168—2016中試樣前處理方法中靜置分離較慢及程序升溫時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，在保證分離度的前提下，對(duì)前處理和程序升溫方法進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)進(jìn)行了方法驗(yàn)證，依據(jù)優(yōu)化方法對(duì)市場(chǎng)上10個(gè)廠家生產(chǎn)的不同批次魚(yú)油保健品進(jìn)行EPA和DHA含量的測(cè)定，為魚(yú)油保健品的辨別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、十一烷酸甲酯和十一烷酸甘油三酯對(duì)照品，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)分別為US170803-21、P0470020、Q3890020和K1850200，含量均大于等于99%；甲醇、正庚烷、異辛烷為色譜純；其余試劑均為分析純；水為一級(jí)水；魚(yú)油保健品，來(lái)自10個(gè)不同廠家。

安捷倫7890B氣相色譜儀，梅特勒XS-105微量分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

將二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯對(duì)照品分別用正庚烷配制成質(zhì)量濃度為0.695、0.557 mg/mL和0.974 5 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，貯存于-10℃以下冰箱。將十一烷酸甘油三酯對(duì)照品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為4.028 4 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，在冰箱中冷藏。

1.2.1.2 供試品溶液的制備(酯交換法)

稱取均勻試樣60.0 mg至具塞試管中，精確至0.1 mg。準(zhǔn)確加入2.0 mL質(zhì)量濃度為4.028 4 mg/mL的十一烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。加入4 mL異辛烷，微熱使試樣溶解后加入200 μL氫氧化鉀甲醇溶液，蓋上玻璃塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。離心[11]，取上清液移至上機(jī)瓶中，待測(cè)。

1.2.2 色譜條件的選擇及測(cè)定

色譜條件：采用安捷倫HP-88色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，進(jìn)樣口溫度270℃，F(xiàn)ID溫度280℃，載氣為氮?dú)?，柱流? mL/min，以程序升溫速率及不同分流比篩選，要求得到的色譜條件應(yīng)滿足理論塔板數(shù)(n)至少2 000/m，分離度(R)至少1.25。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品系列使用液與供試品溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀測(cè)定。以保留時(shí)間定性，以色譜峰峰面積定量。

1.2.3 線性關(guān)系考察

將二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯對(duì)照品儲(chǔ)備液分別用正庚烷稀釋制備系列使用液，二十碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為5.57、11.14、27.85、55.70、278.50 μg/mL和6.95、13.90、34.75、69.50、347.50 μg/mL，十一烷酸甲酯質(zhì)量濃度均為97.45 μg/mL，混勻后備用。精密吸取各使用液1.0 μL，注入氣相色譜儀測(cè)定。

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯質(zhì)量濃度分別為55.70、69.50 μg/mL和97.45 μg/mL的對(duì)照品使用液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1.0 μL，記錄目標(biāo)物峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算響應(yīng)因子(Fi)。

1.2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品6份，按1.2.1.2方法處理。進(jìn)樣量1.0 μL，計(jì)算EPA和DHA的含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；取同一批樣品分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，計(jì)算EPA和DHA的含量及RSD。

1.2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批樣品9份，分別加入對(duì)照品使用液，每個(gè)水平3份，按1.2.1.2方法處理。分別進(jìn)樣1.0 μL，計(jì)算EPA和DHA的含量和回收率。

1.2.7 樣品含量測(cè)定

以建立的方法測(cè)定10個(gè)不同廠家魚(yú)油保健品，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算EPA和DHA的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

GB 5009.168—2016未提出均勻取樣的具體要求，由于實(shí)驗(yàn)需要稱取的樣品質(zhì)量較少，一般取1～2粒軟膠囊即能滿足要求。樣品膠囊間的個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致測(cè)定含量的不同。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本文采用取20粒膠囊混勻后再準(zhǔn)確稱量的方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得結(jié)果精密度較高[12]。

供試品溶液的制備過(guò)程中，后期靜置分離過(guò)程較慢，并隨靜置時(shí)間不同分離效果不同，本文改為5 000 r/min離心7 min，分離效果較好，上清液較靜置效果更清澈，取樣測(cè)定，結(jié)果更精準(zhǔn)，并有效去除了部分雜質(zhì)，減少了雜峰數(shù)量。對(duì)照品和樣品圖譜分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 EPA甲酯和DHA甲酯對(duì)照品圖譜

圖2 樣品圖譜

2.2 色譜條件的優(yōu)化

國(guó)標(biāo)GB 5009.168—2016中的程序升溫方法針對(duì)37種脂肪酸的測(cè)定，出峰時(shí)間較長(zhǎng)。本文分流比優(yōu)化為20∶ 1。將程序升溫條件優(yōu)化為：100℃保持3 min，以10℃/min的速率升溫至200℃，保持20 min，再以4℃/min的速率升溫至240℃，保持10.5 min。優(yōu)化后樣品圖譜見(jiàn)圖3。由圖2和圖3對(duì)比可知，EPA和DHA樣品峰保留時(shí)間分別提前了約21 min和28 min，而其分離度分別為6.13和5.07，符合國(guó)標(biāo)中分離度至少1.25的要求。

圖3 優(yōu)化條件后樣品圖譜

2.3 線性關(guān)系考察

取系列對(duì)照品使用液各1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄目標(biāo)物峰面積(Ai)及內(nèi)標(biāo)峰面積(A11)，計(jì)算Y=Ai/A11和X=ρi/ρ11，根據(jù)Y與X繪制線性回歸曲線，計(jì)算平均響應(yīng)因子Fi=X/Y，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，EPA和DHA分別在5.57～278.50 μg/mL 和6.97～248.50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表1 EPA和DHA線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

測(cè)得目標(biāo)物峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算EPA和DHA平均響應(yīng)因子分別為0.883 5和1.682 6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.43%和1.05%，表明本方法精密度良好[13-14]。

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.2.1.2方法處理樣品，平行處理6份，計(jì)算EPA和DHA的含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.04%和1.62%，說(shuō)明色譜系統(tǒng)重復(fù)性良好。取同一批次樣品分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算EPA和DHA的含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.48%和1.27%，說(shuō)明供試品溶液穩(wěn)定性良好[13-14]。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

EPA和DHA加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 EPA和DHA加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，EPA和DHA加標(biāo)樣品平均回收率分別為100.47%和101.43%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.03%和1.19%，均小于2%，符合含量測(cè)定的準(zhǔn)確性要求[13-14]。

2.7 樣品含量測(cè)定

對(duì)市售的魚(yú)油保健品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中EPA和DHA的測(cè)定含量與標(biāo)示含量對(duì)比 g/100 g

由表3可知，市售的10種魚(yú)油保健品中，EPA和DHA的含量高低不等，其與標(biāo)簽標(biāo)示值相比也有高有低，其中不乏以次充好的產(chǎn)品(如樣品9)。而魚(yú)油中EPA和DHA的配比不同，對(duì)人體產(chǎn)生的保健作用也不盡相同[15]。因此，如何購(gòu)買到質(zhì)量好又適合自己的魚(yú)油保健品，需要有效的測(cè)定方法提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

本文以GB 5009.168—2016為依據(jù)，對(duì)國(guó)標(biāo)方法中的樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)線性關(guān)系考察、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性、加標(biāo)回收等方式對(duì)已建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：EPA和DHA分別在5.57～278.50 μg/mL和6.97～348.50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好。利用已建立的檢測(cè)方法對(duì)市售10個(gè)廠家生產(chǎn)的不同批次魚(yú)油保健品進(jìn)行EPA和DHA的含量測(cè)定，揭示了市場(chǎng)上魚(yú)油保健品質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)狀，為魚(yú)油保健品質(zhì)量規(guī)范的建立提供一定的科學(xué)依據(jù)。