HPLC測定油茶籽油中BaP方法的改進

吳耀祥，佘佳榮，李玉平

(湖南省林產品質量檢驗檢測中心，長沙 410000)

苯并芘有苯并(a)芘和苯并(e)芘兩種異構體，其中苯并(a)芘(BaP)較為常見，是由5個苯環和芘分子組成的多環芳烴化合物，由肉類、油脂等其他食品被過度加熱裂解而產生[1-3]。研究表明，BaP是強致癌物，微小劑量就能引起癌變，對人體細胞具有強烈致突變和致畸性，并可能引起大鼠DNA以及肝細胞損傷[4-6]。目前，世界多數國家已加強對食品中BaP限量管理，相繼出臺許多關于BaP的強制性最低限量值標準。我國GB 2762—2017規定油脂及其制品中BaP限值為10 μg/kg，歐盟629/2008限值為2 μg/kg[6]。

湖南是我國油茶大省，全省油茶種植林區面積和產量都位居前列[7]。由于BaP對油茶籽油親和力較強[8]，且加工過程中的高溫，常會導致成品油里有一定的BaP殘留。因此，建立精準的油茶籽油中BaP檢測方法，對提高油茶籽油質量，保護人類健康有著十分重要的意義。現行的BaP檢測方法有氣相色譜-質譜法[9-10]、HPLC法[11]、HPLC-MS法[12-13]等，而回收率試驗是評價一種檢測方法好壞的重要指標之一。本文在借鑒相關資料[14-17]的基礎上，主要探究提高HPLC法測定油茶籽油中BaP的回收率，并分析導致其回收率低的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二氯甲烷、乙腈均為色譜純，美國TEDIA公司；正己烷為色譜純，CNW公司；質量濃度為4.95 μg/mL 甲醇中BaP標準物質(GBE(E)080476，簡稱BaP標準物質)，中國計量科學研究院。

LC2010A型液相色譜，島津企業管理儀器有限公司；InertSustain C18色譜柱(5 μm×4.6 μm×250 mm)，島津技邇商貿有限公司；UGC-12M型氮吹儀；AL204型電子分析天平；15 mL尖底離心管，美國康寧公司；SBEQ-CG1012固相萃取真空裝置、500 mg，6 mL BaP分子印跡柱；DG-2500R型多管渦旋混合儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 GB 5009.27—2016 凈化方法

稱取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底離心管中，加入以乙腈稀釋配制的質量濃度為49.5 ng/mL的BaP標準溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。將待凈化液轉移至柱子，待液面降至柱床時，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去濾液，用6 mL二氯甲烷洗脫并收集到離心管中，將收集液在40℃氮氣下吹干，準確移取0.4 mL乙腈復溶，2 400 r/min渦旋30 s，過0.45 μm微孔濾膜，待HPLC測定。

1.2.2 改進后凈化方法

稱取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底離心管中，加入以正己烷稀釋配制的質量濃度為49.5 ng/mL的BaP標準溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s。

接受理論本為一種文學批評理論,高舉讀者本身就是作品能動構成的旗幟，認為在作者，作品與讀者的三元關系中，讀者絕不僅僅是被動的部分，沒有讀者的積極參與或未達成讀者的預期視野，那一部作品的歷史生命將是不可思議的。它旨在打破文學作品封閉的圓圈，從一個嶄新的視角重新審視作品，即接受理論的視角。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。將待凈化液轉移至柱子，待液面降至柱床時，用10 mL正己烷淋洗柱子，并適當加壓抽干柱子中殘留液，后棄去濾液，用6 mL二氯甲烷洗脫并收集到離心管中，將收集液在40℃氮氣下吹干，準確移取1 mL乙腈復溶，2 400 r/min渦旋30 s，過0.45 μm微孔濾膜，待HPLC測定。

1.2.3 HPLC條件

等度洗脫；流動相為乙腈0.88 mL/min，水0.12 mL/min；流速1.0 mL/min；熒光檢測器激發波長384 nm，發射波長406 nm；進樣量10 μL；柱溫35℃。

1.2.4 標準曲線的制作

取質量濃度為4.95 μg/mL的BaP標準溶液，用乙腈逐級稀釋成質量濃度為49.5 ng/mL的BaP標準儲備液，再取標準儲備液用乙腈逐級稀釋得到質量濃度為0.495、0.99、4.95、9.9、19.8 ng/mL的標準曲線梯度溶液，轉至液相進樣瓶中，按照1.2.3的色譜條件分析，以質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5 精密度、加標回收率的測定

稱取9份0.4 g油茶籽油，分別加入質量濃度為49.5 ng/mL的標準溶液50、100、150 μL，其對應加標質量為2.475、4.95、7.425 ng，平行重復3次，凈化后進HPLC分析，代入標準曲線中定量并計算精密度和回收率。

2 結果與討論

2.1 改進方法條件的確定

2.1.1 加標液稀釋溶劑的確定

以乙腈、正己烷分別稀釋配制的BaP標準溶液，添加相同加標量，并按照相同的凈化方法和色譜條件檢測，并對比分析兩者的結果，詳見表1。

表1 不同標準溶液稀釋溶劑的HPLC結果

試驗發現，相同的前處理和色譜條件下，兩者色譜圖峰型無明顯差別，出峰時間均在12.5 min左右，峰型好且無拖尾現象，說明該法能使BaP得到較好分離。但正己烷稀釋的峰高、峰面積均比乙腈稀釋的高(見表1)，說明乙腈稀釋的回收率較低，這可能是因為乙腈與油茶籽油親和力較差，在油茶籽油中幾乎不溶，導致BaP大量殘存在乙腈溶液中，并沒有完全溶入油茶籽油；在以正己烷淋洗時把乙腈中的BaP大量洗脫，致使回收率低。而正己烷與油茶籽油親和力強，溶解度大，渦旋時能與油茶籽油均勻混合，則能很好避免淋洗過程中BaP的大量流失。因此，選擇以正己烷稀釋BaP標準溶液作為樣品加標液。

2.1.2 正己烷淋洗體積的確定

稱0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀釋的質量濃度為49.5 ng/mL的BaP標準溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s，取出，轉移至活化好的柱子中，待樣液降至柱床時，分別以6、10 mL正己烷淋洗，后續步驟以1.2.2方法處理，比較兩者液相色譜分析的結果見表2。

表2 不同體積正己烷淋洗的HPLC結果

從表2可以看出，不同體積的正己烷淋洗后的分離效果都較好，但以10 mL正己烷淋洗后的譜圖峰高較高，峰面積明顯較大，說明信號響應值高，BaP檢出值大。可能是因為對于0.4 g油茶籽油，當正己烷淋洗體積為6 mL時，其淋洗程度略顯不夠，會導致油茶籽油洗脫不完全，凈化不徹底，會隨著二氯甲烷洗脫時一起流入試管中，污染凈化液，影響結果。試驗發現，加大正己烷淋洗體積至10 mL，分數次洗滌，后適當加壓使柱中殘留液全部流出，再以二氯甲烷洗脫，其效果更好。因此，選擇以10 mL正己烷淋洗。

2.1.3 乙腈復溶體積的確定

稱0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀釋的質量濃度為49.5 ng/mL的BaP標準溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s，取出，轉移至活化好的柱子中，待樣液降至柱床時，以10 mL正己烷淋洗，6 mL二氯甲烷洗脫，分別以0.4、1 mL乙腈復溶。結果發現添加0.4 mL乙腈不能很好地溶解樣品，而1 mL乙腈可完全溶解樣品，因此選擇1 mL乙腈進行復溶。

2.2 標準曲線

按照1.2.4的方法操作，得出標準曲線方程為y=29 702x+16 125,R2=0.998 1。BaP質量濃度在0.495～19.8 ng/mL范圍內，峰面積與BaP質量濃度呈現良好的線性關系。

2.3 精密度與回收率

按照1.2.5采用改進前后的方法進行精密度和加標回收率試驗，結果見表3。

表3 兩種方法精密度與加標回收率結果對比

從表3可知，改進前的方法的回收率基本穩定在32.48%～47.27%之間，說明在前處理時造成了BaP的大量流失，同時其RSD值也說明，這種變化是穩定的。而改進后的方法回收率增至91.68%～120.62%，且RSD值小，說明精密度和準確性都進一步提高了。

3 結 論

本文在GB 5009.27—2016的基礎上，改進HPLC檢測油茶籽油中BaP的方法，通過對試驗結果的對比分析得出，以正己烷稀釋配制的BaP標準溶液作為加標液，加大正己烷淋洗體積至10 mL，乙腈復溶體積至1 mL，能夠大大提高回收率。改進后的方法操作簡單，科學合理，有效提高了檢測的準確性。