乳清蛋白抗氧化肽的制備及體外抗氧化活性研究

孫 敏，李 誠，劉愛平，方旎凡，杜 遷，楊 浩

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014)

生物活性肽是結構介于氨基酸與蛋白質之間，含有2～20個氨基酸，對生物的生命活動具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋白片段[1]。抗氧化肽活性強，相對分子質量小，易吸收，能捕捉和消除生物體內多余自由基，延緩脂質過氧化[2-3]，已成為國內外研究較多的一種生物活性肽。國內外研究者已經從沙丁魚[4]、豬皮[5]、蛋清[6]、大米[7]、大豆[8]、玉米[9]等動植物蛋白酶解液中分離純化具有顯著抗氧化活性的肽段。

乳清是奶酪和酪蛋白生產過程中的副產物，全世界乳清年產量為180×106～190×106t，但只有50%的乳清被利用[10]。乳清中含有乳糖、乳清蛋白、脂肪、維生素和礦物質等營養物質。如果乳清中的蛋白質未充分回收而直接排放乳清，必會造成資源的極大浪費。近年來隨著乳源生物活性肽研究的興起，乳清蛋白中具有生物活性的肽段被越來越多的研究者發現[2,11-12]。利用乳清蛋白開發功能肽產品，不僅可以減少浪費，減輕污染，還能提高產業附加值。本研究先篩選酶解乳清蛋白的最佳蛋白酶，然后在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的工藝條件，并在體外評價其抗氧化活性，旨在為乳清蛋白的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

乳清蛋白：市售(蛋白質含量為79.69%)；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，美國Sigma公司；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計；D-37520高速冷凍離心機、Varioskan Flash酶標儀，美國Thermo Fisher公司；HH數顯恒溫水浴鍋；QT-2旋渦混合器。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳清蛋白抗氧化肽的制備

乳清蛋白→溶解→沸水浴10 min →冷卻至室溫→調pH→加酶恒溫酶解→沸水浴10 min→離心→乳清蛋白抗氧化肽。

以5種蛋白酶為對象，選擇加酶量5 000 U/g，在最適條件(見表1)下酶解3 h后離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液，測定上清液多肽含量和羥自由基清除率，篩選最適蛋白酶。以篩選的蛋白酶為研究對象，進一步研究酶解pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、酶解時間(1、2、3、4、5 h)、酶解溫度(50、55、60、65、70℃)、底物質量分數(1%、3%、5%、7%、9%)和加酶量(1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 U/g)對酶解效果的影響。

表1 蛋白酶酶解條件

1.2.2 多肽含量測定

Lowry 法中酶標儀法，具體參照試劑盒說明書進行。

1.2.3 體外抗氧化活性測定

將在最優條件下制備的乳清蛋白抗氧化肽配制成不同質量濃度(1、2、3、4、5 mg/mL) 溶液，分別測定其對羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率并與相同質量濃度的VC比較。羥自由基清除率測定參照徐懷德等[13]的方法；ABTS+自由基清除率測定參照綦蕾等[14]的方法；DPPH自由基清除率測定參照張周莉等[15]的方法；超氧陰離子自由基清除率測定參照Pan等[16]的方法。

1.2.4 數據處理

用Microsoft Excel 2010進行數據處理，SPSS 22進行顯著性分析，Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗數據統計分析，每個處理平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g條件下，在各蛋白酶最適溫度和最適pH下酶解3 h，不同蛋白酶對酶解效果的影響如圖1所示。

圖1 酶種類對酶解效果的影響

由圖1可知，中性蛋白酶酶解液中多肽含量最高，達到 35.02 mg/mL，而酸性蛋白酶酶解液中多肽含量最低，僅為 25.43 mg/mL。并且中性蛋白酶酶解液對羥自由基清除能力最強，清除率達到66.69%，菠蘿蛋白酶酶解液對羥自由基清除能力最弱，清除率僅為53.58%。因此，選擇中性蛋白酶為最優酶進行后續酶解工藝的優化。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH對酶解效果的影響

在底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g、酶解溫度55℃、酶解時間3 h條件下，不同pH對酶解效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著pH的增大，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先上升后下降趨勢。當pH為6.0時，酶解液對羥自由基清除能力最強，清除率達到72.29%，此后，隨著pH的增加，羥自由基清除率下降；多肽含量在pH為7.0時達到最大值，為35.79 mg/mL。這可能是反應體系的pH會直接影響酶分子及底物的解離狀態，進而影響酶與底物的結合，最終影響酶解液的多肽含量和羥自由基清除活性[17]。因此，確定酶解適宜的pH為6.0。

圖2 pH對酶解效果的影響

2.2.2 酶解時間對酶解效果的影響

在pH 6.0、底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g、酶解溫度55℃條件下，不同酶解時間對酶解效果的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響

由圖3可知，隨酶解時間的延長，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量都呈先上升后下降的趨勢。當酶解時間為2 h時，酶解液清除羥自由基的能力最強，清除率達到了73.09%。在酶解時間為3 h時，酶解液中多肽含量達到最高，為32.67 mg/mL。之后酶解液的多肽含量和羥自由基清除率都隨酶解時間的延長而緩慢降低。可能是因為隨酶解時間的延長，具有抗氧化活性的片段被進一步水解成氨基酸，導致活性降低[18]。因此，確定最適酶解時間為2 h。

2.2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時間2 h、底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g條件下，不同酶解溫度對酶解效果的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨酶解溫度的升高，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先上升后下降趨勢。中性蛋白酶的最適溫度在55℃左右，此時多肽含量最高，達到36.12 mg/mL,而酶解液對羥自由基清除能力并非最強。當酶解溫度達到60℃時，酶解液對羥自由基清除能力最強，清除率達到73.98%，此后，隨酶解溫度的升高，多肽含量和羥自由基清除率都下降。可能是過高的溫度使得維持酶分子結構的次級鍵斷裂，導致酶活性降低，延緩酶解進程[19]。因此，確定最適酶解溫度為60℃。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響

2.2.4 底物質量分數對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時間2 h、酶解溫度60℃、加酶量5 000 U/g條件下，不同底物質量分數對酶解效果的影響如圖5所示。

圖5 底物質量分數對酶解效果的影響

由圖5可知，隨著底物質量分數的增加，酶解液對羥自由基清除率呈先上升后下降趨勢，而多肽含量一直上升。當底物質量分數從1%增加到5%時，多肽含量迅速增加，而羥自由基清除率先上升后下降，在底物質量分數為3%時，羥自由基清除率達到最高，為72.73%。在底物質量分數為5%時，酶解液對羥自由基清除率為71.35%， 僅次于最高清除率，多肽含量則為 35.31 mg/mL，遠高于底物質量分數為3%時的多肽含量。因此，確定最適底物質量分數為5%。

2.2.5 加酶量對酶解效果的影響

在pH 6.0、酶解時間2 h、酶解溫度60℃、底物質量分數5%條件下，不同加酶量對酶解效果的影響如圖6所示。

由圖6可知，隨著加酶量的增加，酶解液對羥自由基清除率和多肽含量均呈先升高后下降趨勢。這可能是因為當底物質量分數一定時，增大加酶量，底物蛋白水解越充分，生成的小肽越多，之后隨著加酶量過多，過量的酶分子反而抑制了中間產物轉化為酶解終產物，使得多肽含量下降。在加酶量為5 000 U/g 時，酶解液對羥自由基清除率最大，為73.56%，多肽含量為34.44 mg/mL，僅次于最高的多肽含量。因此，確定5 000 U/g為最適加酶量。

圖6 加酶量對酶解效果的影響

2.3 響應面法優化試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，固定底物質量分數為5%、加酶量為5 000 U/g，選取pH(A)、酶解溫度(B)和酶解時間(C)為自變量，以羥自由基清除率(Y)為響應值，根據響應面分析法中心組合設計原理進行響應面試驗。響應面試驗因素水平見表2，響應面試驗設計及結果見表3。

表2 響應面試驗因素水平

表3 響應面試驗設計及結果

2.3.2 響應面優化及結果

利用Design-Expert 8.0 軟件進行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：Y=72.71-0.79A-0.60B-0.14C-3.48AB+0.32AC-1.29BC-1.38A2+0.39B2-1.5C2。

對該回歸模型的顯著性進行方差分析，結果見表4。

表4 方差分析

注：* * 表示差異極顯著(P<0.01)，* 表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 響應面優化與驗證

對試驗結果進行優化，得到乳清蛋白抗氧化肽制備的最佳條件為pH 5.51、酶解溫度64.67℃、酶解時間1.655 h、底物質量分數 5%、加酶量5 000 U/g，此時乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率預測值為75.52%。考慮到實際可操作性，將制備工藝條件調整為pH 5.50、酶解溫度65℃、酶解時間1.65 h、底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g，在此條件下進行驗證試驗，測得乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率為74.54%，與預測值吻合度達到98.70%，試驗值與回歸方程預測值吻合較好，說明建立的模型能夠很好地預測乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率。

2.4 乳清蛋白抗氧化肽的體外抗氧化活性

2.4.1 羥自由基清除活性(見圖7)

圖7 乳清蛋白抗氧化肽的羥自由基清除活性

由圖7可知，乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率弱于VC，隨著其質量濃度的增加，對羥自由基清除能力逐漸增強，并呈一定的量效關系。乳清蛋白抗氧化肽質量濃度為5 mg/mL時，對羥自由基清除率達到75.25%，為相同質量濃度VC的74.83%，其IC50值為2.174 mg/mL。

2.4.2 ABTS+自由基清除活性(見圖8)

圖8 乳清蛋白抗氧化肽的ABTS+自由基清除活性

由圖8可知，乳清蛋白抗氧化肽對ABTS+自由基清除率隨著樣品質量濃度的增加而升高。樣品質量濃度從1 mg/mL增加到2 mg/mL時，對ABTS+自由基清除率從68.15%增加到88.16%，增幅較大，之后隨著樣品質量濃度的增加對ABTS+自由基清除率緩慢增加。樣品質量濃度為5 mg/mL時，對ABTS+自由基清除率達到99.11%，接近于同質量濃度VC的清除率，IC50值為0.709 mg/mL。

2.4.3 DPPH自由基清除活性(見圖9)

圖9 乳清蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除活性

由圖9可知，乳清蛋白抗氧化肽對DPPH自由基清除率隨樣品質量濃度增加而升高，并呈一定的量效關系。乳清蛋白抗氧化肽質量濃度為5 mg/mL 時，對DPPH自由基清除率為68.79%，為相同質量濃度VC的69.76%，樣品的IC50值為2.813 mg/mL。

2.4.4 超氧陰離子自由基清除活性(見圖10)

圖10 乳清蛋白抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除活性

由圖10可知，乳清蛋白抗氧化肽對超氧陰離子自由基清除率隨樣品質量濃度增加而升高，并且呈現良好的量效關系。樣品質量濃度為5 mg/mL 時，對超氧陰離子自由基清除率為51.36%，僅為相同質量濃度VC的51.46%，相對于 VC有一定差距，樣品的IC50值為4.579 mg/mL。

3 結 論

本研究表明酶解乳清蛋白較佳蛋白酶為中性蛋白酶。在單因素試驗的基礎上利用響應面法得到酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為pH 5.50、酶解溫度65℃、酶解時間1.65 h、底物質量分數5%、加酶量5 000 U/g，在此條件下乳清蛋白抗氧化肽對羥自由基清除率為74.54%，與模型預測值(75.52%)無顯著差異，說明通過響應面試驗得到的回歸方程能較好預測結果。隨著乳清蛋白抗氧化肽質量濃度增加，其對羥自由基清除率、ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率都增大，并呈一定量效關系，IC50值分別為2.174、0.709、 2.813 mg/mL和4.579 mg/mL。表明乳清蛋白抗氧化肽具有較強的體外抗氧化活性，在天然抗氧化劑和保健食品中有一定的開發利用價值。