花生肽鈣復合物鈣結合特性及氨基酸組成研究

袁興宇，包小蘭，馮文君，馮國雪

(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

花生是一種重要的油料作物，含有豐富的蛋白質，利用花生蛋白通過不同條件酶解制備得到不同的功能性多肽，這些多肽具有抗氧化、降血脂、降膽固醇等生理活性[1-3]，具有極高的研究價值。前期研究發現，花生肽可以與鈣離子結合形成水溶性復合物[4]，如何進一步提高花生肽的鈣結合量并明確其鈣結合特性及氨基酸組成，對其促進人體鈣吸收的研究及功能性食品的開發具有重要意義。有研究表明，大豆肽具有較好的鈣結合能力[5]，通過谷氨酰胺酶對大豆肽進行脫酰胺處理，可以顯著提高大豆肽的鈣結合量[6]。谷氨酰胺酶是否也會對花生肽的鈣結合量產生影響目前尚不明確。為此本研究探討了脫酰胺處理對花生肽鈣結合量的影響，并研究了花生肽鈣復合物的鈣結合特性及氨基酸組成，為進一步探究花生肽對促進人體鈣吸收的影響及功能性食品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花生分離蛋白(實驗室自制)；Protease M(51.5 AU/g,粉體)、谷氨酰胺酶(日本天野酶制劑株式會社)；氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉等，分析純；即用型透析袋(MWCO為500 Da，31 mm，美國光譜醫學)。

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-6電熱恒溫水浴鍋；PB-10酸度計；MS-H280-PRO恒溫加熱磁力攪拌器；SC-3612低速離心機；LGJ-25C冷凍干燥機；BCD-223MTX新飛冰箱；HJ-1磁力攪拌器；Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀，美國 Nicolet公司；S-3000N掃描電子顯微鏡、L-8900氨基酸自動分析儀，Hitachi日立有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生肽的制備

稱取1 g花生分離蛋白于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，用1 mol/L HCl調節pH至3，放入50℃恒溫水浴中加入0.01 g Protease M，保持50℃酶解60 min。酶解后90℃水浴滅酶10 min。冷卻至室溫，3 000 r/min離心20 min，取上清液，用1 mol/L NaOH調節pH至7.4，冷凍干燥，得到花生肽。

1.2.2 花生肽的脫酰胺處理[7-8]

將花生肽配制成2%溶液，在pH 7.0、50℃的條件下添加谷氨酰胺酶(酶底比1∶ 50)進行酶解，分別在酶解時間為0、60、120、180、240 min時取樣，脫酰胺反應后90℃水浴滅酶10 min，取上清液真空冷凍干燥，得到脫酰胺花生肽。

1.2.3 花生肽脫酰胺率的測定[9]

稱取樣品0.05 g于螺口培養管中，加入5 mL、3 mol/L鹽酸，放入110℃烘箱中干燥3 h。然后取康威氏皿，在中央內室加入2%硼酸3 mL和指示劑1滴，在外室一側加入處理好的樣品2 mL，另一側加飽和K2CO3溶液3 mL，將康威氏皿放入30℃恒溫箱中，36 h后取出。最后用0.01 mol/L HCl滴定內室吸收液，以藍紫色為終點。脫酰胺率的計算公式如下。

脫酰胺率=(脫酰胺處理前滴定值-脫酰胺處理后滴定值)/脫酰胺處理前的滴定值×100%

1.2.4 花生肽鈣復合物的制備及鈣結合量的測定

稱取10 mg脫酰胺花生肽溶解于蒸餾水中，配制成10%的溶液，在37℃水浴中放置10 min，使其充分溶解。然后加入5 mL 0.06 mol/L的CaCl2溶液，反應30 min后，離心(4 500 r/min，20 min)。取上清液加入到透析袋中，將透析袋用專用夾夾緊，轉移到裝有蒸餾水的燒杯中，在冰箱內(4℃)用磁力攪拌器進行透析，以除去游離鈣。透析過程中每4 h更換1次透析液，持續透析48 h，取部分樣品冷凍干燥，即為花生肽鈣復合物。其余樣品移到容量瓶中，透析袋用蒸餾水沖洗3次，定容到30 mL，采用原子吸收光譜法測定透析液中鈣的含量，計算鈣結合量。

1.2.5 掃描電鏡分析

取少量脫酰胺花生肽及其肽鈣復合物冷凍干燥樣品進行真空噴金。加速電壓設為15 kV，使用S-3000N掃描電子顯微鏡對樣品微觀結構進行觀察，在600倍與1 500倍下獲取掃描圖像。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析[10]

稱取微量凍干粉樣品放于金剛石窗片上，壓平后在Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀中檢測，掃描64次，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 花生肽鈣復合物氨基酸組成分析

稱取脫酰胺花生肽鈣復合物樣品10 mg，用6 mol/L鹽酸在100℃下水解24 h，水解液脫酸后用磷酸緩沖液(pH 2.2)定容，使用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。

1.2.8 統計與分析

每個實驗重復3次，利用SPSS19.0軟件進行統計分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 脫酰胺處理對花生肽鈣結合量的影響

前期研究發現酶解60 min水解度為11.83%的花生酶解物的鈣結合量為82.05 mg/g，其鈣結合量顯著高于酶解30、90、120、150 min的酶解物的鈣結合量，因此本研究選取酶解時間為60 min的產物進行進一步研究。以花生分離蛋白為原料，采用蛋白酶Protease M將其酶解60 min獲得花生肽，得率為23.73%，進一步采用谷氨酰胺酶對其進行脫酰胺處理，分別在處理0、60、120、180、240 min取樣，獲得脫酰胺花生肽，制備花生肽鈣復合物，測定花生肽脫酰胺率及鈣結合量，結果如表1所示。

表1 花生肽的脫酰胺率及鈣結合量

注：同列數字不同字母上標為有顯著性差異(P<0.05)。

由表1可知，花生肽的鈣結合能力隨著脫酰胺時間的延長及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，在脫酰胺時間為180 min、脫酰胺率為35.86%時其鈣結合量達到134.41 mg/g，鈣結合量顯著提升了52.36 mg/g。繼續延長脫酰胺時間，花生肽的脫酰胺率及鈣結合量無顯著變化(P<0.05)。說明脫酰胺處理可以提高花生肽的鈣結合量。主要原因是通過脫酰胺反應使肽鏈上的羧基更多暴露出來[11-13]，從而增加了鈣的結合位點。

2.2 花生肽與鈣的結合特性

由2.1可知，脫酰胺可以顯著提高花生肽的鈣結合量，但花生肽與鈣的具體結合特性尚未明確。選取鈣結合量最高的脫酰胺時間為240 min的花生肽制備花生肽鈣復合物，花生肽鈣復合物得率為86.75%。對該肽鈣復合物及未與鈣反應的脫酰胺花生肽進行電鏡掃描，得到的掃描電鏡圖如圖1所示。

圖1 花生肽(H)及其肽鈣復合物(H-Ca)的600倍(A)、1 500倍(B)掃描電鏡圖

由圖1可知，花生肽呈現疏松片狀結構，這是由于真空冷凍干燥時水分升華后親水區所留的痕跡[14]。加鈣反應后，花生肽鈣復合物微觀結構發生變化，片狀結構轉化為顆粒狀結構，這一研究結果與劉閃等[15]對白鰱魚骨膠原多肽及Peng等[16]對太平洋鱈魚骨肽與鈣反應的掃描電鏡研究結果一致。

進一步通過傅里葉變換紅外光譜對花生肽及其肽鈣復合物進行分析，結果如圖2、表2所示。

注：A.脫酰胺花生肽；B.脫酰胺率為0的花生肽鈣復合物；C.脫酰胺率為19.72%花生肽鈣復合物；D.脫酰胺率為39.21%的花生肽鈣復合物。下同。

圖2 花生肽及其肽鈣復合物的中紅外光譜圖

表2 脫酰胺前后花生肽及其肽鈣復合物的中紅外光譜主要頻率譜帶 cm-1

2.3 花生肽鈣復合物的氨基酸組成

不同多肽具有的不同生理活性與其氨基酸組成相關，有研究[17]報道稱谷氨酸及天冬氨酸在鈣結合過程中起著重要的作用，肽段中酸性氨基酸含量與其鈣結合量呈線性相關。利用氨基酸自動分析儀對脫酰胺時間為240 min花生肽鈣復合物的氨基酸組成進行分析，結果如表3所示。

表3 花生肽鈣復合物的氨基酸組成 %

由表3可知，花生肽中含有大量的谷氨酸(23.49%)和天冬氨酸(10.76%)，表明花生肽鈣復合物中含有較多酸性氨基酸，酸性氨基酸含量對花生肽鈣結合量具有重要的作用。

于濟洋[18]探究了菊芋蛋白的鈣結合特性，發現高鈣結合量的組分中含有較多的谷氨酸，Liu等[19]研究麥胚肽與鈣離子的螯合特性，表明高鈣結合能力的麥胚肽含有較多的谷氨酸和天冬氨酸，與本研究結果相一致，表明酸性氨基酸含量是花生肽具有高鈣結合量的重要因素。

3 結 論

(1)花生肽的鈣結合能力隨著脫酰胺時間的延長及脫酰胺率的增加得到了顯著的提高，表明脫酰胺處理可以提高花生肽的鈣結合量。脫酰胺處理時間為 240 min時，花生肽的鈣結合量最大，為135.26 mg/g。

(2)掃描電鏡分析結果發現加鈣反應后花生肽微觀結構由疏松片狀結構聚合為顆粒狀結構；傅里葉紅外光譜分析表明花生肽鏈上的氨基及羧基是鈣的主要結合位點，脫酰胺處理后羧基上的氧原子與鈣的配位作用得到增強，促進了花生肽鈣結合量的提高。

(3)花生肽鈣復合物的氨基酸組成中天冬氨酸(10.76%)及谷氨酸含量(23.49%)較高，表明酸性氨基酸含量是花生肽具有高鈣結合量的重要因素。