穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡 及生物鐘的影響*

王曜暉，趙智權(quán)，杜運(yùn)松，袁冰舒，王剛

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

穗花杉雙黃酮是卷柏中的一種多酚化合物[1]，具有降低血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗輻射及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[2-15]。肥胖與前脂肪細(xì)胞的過度分化、增生及脂肪細(xì)胞肥大密切相關(guān)[16]。肥胖機(jī)體出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，相關(guān)炎癥基因表達(dá)升高[17]。晝夜節(jié)律運(yùn)動輸出周期故障蛋白（circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK）、腦及肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1（the brain and muscle arnt-like protein-1, BMAL1）的異常表達(dá)可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異 常[18-20]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的穗花杉雙黃酮作用于正常和過表達(dá)CLOCK的3T3-L1細(xì)胞后，觀察其對3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其與生物鐘基因的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穗花杉雙黃酮（160523，純度＞98%）購自成都瑞芬恩科技有限公司，3T3-L1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，鼠抗CLOCK、兔抗BMAL1、兔抗Cleaved caspase-3及兔抗Bcl-2均購自美國Proteintech公司，抗鼠二抗、抗兔二抗及Click-iTTMEdU Alexa FluorTM555 Imaging Kit均購自美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和RealMasterMix（SYBR Green）購自北京天根生物化學(xué)科技有限公司，正反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 主要儀器

CFX96 touch熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司），Gallios流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物配制穗花杉雙黃酮用二甲基亞砜溶解，儲存濃度為10 g/L，0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们坝门囵B(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和分組3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%二氧化碳CO2。穗花杉雙黃酮按0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 mg/L質(zhì)量濃度分成6組。

1.3.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖將3T3-L1細(xì)胞接種到96孔板……