精神分裂癥患者腸道菌群結構特征初步觀察與分析☆

黃俠 卓敏 李時佳 吳逢春 陳軍 韓俊南 吳凱*※

近年來，由于腸道菌群與人類健康和疾病的關系密切而備受關注。腸道菌群不僅可調控食物消化能力，維持免疫系統的運作，而且能通過腦—腸—微生物軸影響大腦的活動[1-3]。已有動物研究表明，改變腸道菌群組成能誘導動物產生類似精神類疾病的癥狀和行為[4-5]，并且在動物模型中已證實腸道菌群改變與孤獨癥存在關聯[6-7]。但是，有關人類精神分裂癥與腸道菌群相關性的研究仍少有報道[8-10]，且腸道菌群是個復雜且龐大的生態系統，不同地區、不同年齡階段人群其腸道菌群都存在一定差異。因此，本研究對精神分裂癥患者腸道菌群進行16S rRNA基因高通量測序，探索其腸道菌群特征，及可能的病理機制，為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年4月至2017年12月就診于廣州市惠愛醫院門診及住院的精神分裂癥患者作為患者組。入組標準：①符合《美國精神障礙診斷與統計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標準；②年齡18～45歲；③病程≥2年，目前使用的抗精神病藥物種類和劑量在8周內穩定；④血常規檢查無異常；⑤無精神活性物質濫用或依賴（酒精、咖啡因、尼古丁除外）。排除標準：①患有糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓、心臟病等可能影響腸道菌群穩定性的疾病；②近3個月內有腹瀉；③近3個月內使用過抗生素類或益生菌類藥物；④妊娠、哺乳期或月經期婦女；⑤合并其他符合DSM-Ⅳ診斷標準的精神疾病。共收集16例患者。

對照組來自同一時間段內在廣州大學城公開招募的健康志愿者。入組標準：①不符合DSM-Ⅳ任何精神疾病的診斷；②無精神疾病史及家族史；③年齡18～45歲；④血常規檢查無異常；⑤無精神活性物質濫用或依賴 （酒精、咖啡因、尼古丁除外）。排除標準同患者組。共收集20名對照者。

本次研究經過廣州市惠愛醫院倫理委員會批準。所有受試者簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取和16S rRNA測序 采集所有受試者的新鮮糞便樣本于50 mL無菌采便盒內，-80℃保存。根據TIANamp Stool DNA Kit（天根生化科技有限公司）說明書提取總DNA，用NanoDrop 2000c（Thermo Scientific）測定DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。以細菌16S rRNA基因的V3可變區為目標片段，擴增DNA構建測序文庫，使用Ion PGMTM測序儀（博奧木華基因科技有限公司）進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 采用 Qiime（Quantitative Insights into Microbial Ecology）1.8.0 軟件 （http：//qiime.org/）對原始序列進行優化處理，得到高質量序列[11]。以UCLUST算法為基礎，將高質量序列以97%核苷酸序列相似性聚類成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）， 應用 Green-Gene數據庫（version 13.8）對OTUs進行物種信息注釋。基于OTUs的注釋信息，計算α多樣性（Chao1指數、Ace指數、Shannon指數和 Simpson指數）。根據細菌的門和屬兩個水平上序列數的統計信息，將各物種豐度歸一化到同一數量級，用log2（患者組/對照組）計算樣品之間物種豐度的倍數差異，進而分析不同菌群相對豐度的組間差異[12]。采用線性判別效應分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）描述兩組間具有統計學差異的菌群標志物，并用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）估計每個差異菌群的效應大小，本研究LDA判別界值取1.5。為深入了解腸道菌群在兩組中發揮的生物學作用，利用PICRUSt軟件，結合GreenGene數據庫和KEGG數據庫，對16S rRNA數據進行功能譜預測。

1.3 統計學分析統計學分析使用SPSS 23.0。兩組被試年齡、腸道菌群α多樣性指數等正態分布的數據采用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗。性別等組間比較采用Fisher精確檢驗。門、屬水平上的腸道菌群相對豐度呈偏態分布，采用中位數（下四分位數，上四分位數）[M（QL，QU）]描述，過濾掉在少于 20%被試中存在的OTUs后，采用Wilcoxon秩和檢驗進行組間比較。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 人口學資料患者組年齡（33.63±8.04）歲，男性 7例，女性 9例；對照組年齡（27.60±7.07）歲，男性16名，女性 4名。兩組年齡（t=-2.391，P=0.022）、性別（P=0.038）差異有統計學意義。患者組的病程為（5.19±3.76）年，發病年齡為（28.44±7.44）歲，使用抗精神病藥物為奧氮平、利培酮、舒必利中兩種或三種。

2.2 菌群多樣性分析對36例糞便樣本DNA進行測序，共獲得12436779條高質量序列，其中患者組6556239條。通過序列相似性聚類，得到5475個 OTUs，其中患者組4513個，對照組 4545個，3583個為兩組共有。α多樣性分析表明，兩組的 Chao1 指數（t=-1.056，P=0.298）、Ace 指數（t=-1.254，P=0.218）、Shannon 指數（t=0.070，P=0.945）和 Simpson 指數（t=0.155，P=0.878）均沒有統計學差異（表 1）。

2.3 菌群結構分析在門水平上，對照組的優勢菌群主要屬于厚壁菌門 （Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），占總細菌的93.73%，梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）合占1.99%，其它細菌占剩下的4.28%。與對照組相比，患者組的優勢菌群未改變，厚壁菌門和擬桿菌門占總細菌的90.60%，厚壁菌門與擬桿菌門的相對豐度比值、梭桿菌門與變形菌門相對豐度比值較對照組略變大，放線菌門的相對豐度有所增加，但變化均無統計學意義（P＞0.05）。低豐度的TM7門菌群在患者組中的相對豐度較對照組增加，且差異有統計學意義（Z=-2.042，P=0.041）（表 2）。

表1 精神分裂癥患者與對照腸道菌群α多樣性分析

表2 精神分裂癥患者與對照門水平上的腸道菌群相對豐度及其比值

在屬水平上，對照組糞便中占主導地位菌屬有擬桿菌屬（Bacteroides，21.02%）、普雷沃氏菌屬（Prevotella，10.43%）、糞桿菌屬（Faecalibacterium，6.58%）和巨單胞菌屬（Megamonas，1.36%），而患者組以擬桿菌屬（34.39%）、糞桿菌屬（4.35%）、梭桿菌屬 （Fusobacterium，1.09%）、 巨單胞菌屬（0.23%）為優勢菌屬（圖1，表3）。與對照組相比，患者組有8個菌屬的相對豐度均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。其中5個屬于放線菌門，分別為放線菌屬（Actinomyces）（Z=-2.010，P=0.044）、羅氏菌屬 （Rothia）（Z=-2.702，P=0.007）、 斯卡多維亞氏菌屬（Scardovia）（Z=-2.701，P=0.007）、奇異菌屬（Atopobium）（Z=-2.076，P=0.038）和伊格爾茲氏菌屬 （Eggerthella）（Z=-2.019，P=0.043）；3 個屬于厚壁菌門，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）（Z=-2.570，P=0.010）、Moryella（Z=-3.014，P=0.003）和G07菌屬（Z=-1.983，P=0.047）（表 3）。進一步LEfSe分析發現，以上8個組間差異菌屬中，除羅氏菌屬和伊格爾茲氏菌屬之外，其余6個在兩組間具有統計學差異（P＜0.05）（圖 2A）。

此外，在科水平上，患者組中消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、放線菌科（Actinomycetaceae）3個科的相對菌群豐度高于對照組 （P＜0.05），而組織菌科（Tissierellaceae）的相對豐度低于對照組（P＜0.05）（圖 2B）。

圖1 對照組和患者組在屬水平上腸道主要菌群組成分布圖

圖2 對照組和患者組腸道菌群組成的LEfSe分析。A為僅對LDA≥1.5的分類群進行可視化；B為兩組間差異最大的菌群

2.4 菌群功能分析功能分析結果顯示患者組和對照組有多種生物學途徑存在差異 （P＜0.05），包括β-丙氨酸、核黃素、磷酸鹽、脂肪酸和丙酮酸等代謝途徑，苯甲酸、二甲苯、二噁英、萘、氯烷烴和氯烯烴等降解途徑，四環素和脂肪酸生物合成途徑，糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑等（圖3）。

圖3 對照組和患者組腸道菌群功能預測分析。圖中為相對豐度在兩組之間差異有統計學意義的生物學途徑（P＜0.05），右側P值為校正后的值

3 討論

健康人腸道菌群主要由厚壁菌門（60%～80%）、擬桿菌門（20%～30%）、放線菌門（＜10%）和變形菌門（＜1%）組成[13-18]。本研究也發現，對照組中相對豐度較高的門類為厚壁菌門（46%）和擬桿菌門（47%），只是兩者的占比稍有變化，可能是本研究樣本量較小，不足以顯示其分布狀況，也可能與受試者的飲食習慣和地理環境等因素有關。本研究中，與對照組相比，患者的腸道菌群發生改變：在門水平，TM7門菌群相對豐度偏高；在科水平，消化鏈球菌科、乳桿菌科和放線菌科的菌群相對豐度偏高，而組織菌科的相對豐度偏低；在屬水平，6個菌屬的相對豐度均偏高，其中3個屬于放線菌門（放線菌屬、奇異菌屬和斯卡多維亞氏菌屬），3個屬于厚壁菌門 （乳桿菌屬、Moryella和G07菌屬）。SCHWARZ等[19]研究發現首發精神病患者糞便中乳桿菌屬的相對豐度比健康對照組高，且乳桿菌屬豐度與癥狀的嚴重程度呈正相關；此外，SHEN等[9]發現在精神分裂癥緩解期患者腸道中乳桿菌屬的相對豐度也高于健康對照組。本研究與這些文獻結果一致，同時也提示乳桿菌屬相對豐度升高與精神分裂癥的發生發展有一定相關性[20]。總的來說，本研究發現精神分裂癥患者腸道菌群較健康對照者發生改變，這些變化的菌群可能在精神分裂癥發病中發揮重要生物學作用，有望為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供一定參考。

表3 精神分裂癥患者與對照屬水平上的腸道菌群相對豐度

大腦的認知功能與其能量供應能力協同進化，精神分裂癥患者存在認知功能障礙，其大腦中能量代謝存在異常[21-22]。對精神分裂癥患者尸檢的研究將大腦前額葉皮質組織樣本進行轉錄、蛋白質和代謝組學分析發現，脂肪酸β-氧化酶的轉錄水平顯著增加[23]，而血清和尿液分析推測脂肪酸代謝途徑在患者中占主要地位[24]。本研究發現精神分裂癥患者體內脂肪酸代謝和丙酮酸代謝途徑與健康對照存在差異。丙酮酸合成、乙酰CoA合成和脂肪酸生物合成是合成短鏈脂肪酸（short chain fat acid，SCFAs）的三種基本反應。HE 等[10]通過分析受試者腸道微生物群的組成和腦內細胞膜破壞的標志物（即膽堿），得到精神分裂癥高風險和超高風險受試者腦—腸—微生物軸的特征，其中，超高風險受試者腸道中乳桿菌屬相對豐度增加可以刺激腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）的產生，本研究中也發現患者組乳桿菌屬水平增加。另外，SCFAs可與體內TNF穿過血腦屏障進入中樞神經系統，激活小膠質細胞，干擾神經細胞的膜代謝，進而誘發精神分裂癥[7，25]。據此，推測腸道微生物變化可能引起機體能量代謝異常，菌群代謝物異常，誘導炎癥因子水平改變，進而引起精神分裂癥發生。基于此，未來可以擴大樣本量進行縱向深入的研究，建立腸道微生物與血清代謝物相結合的預測模型，用于精神分裂癥的臨床輔助診斷和治療。

本研究分析精神分裂癥患者和健康對照者腸道菌群的差異，為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供一定參考。但也存在以下局限：樣本量較小，未考慮飲食習慣、生活方式等對腸道菌群的影響等，此外，本研究中的患者在入組時已經服用抗精神病藥物，無法分析患者用藥前后腸道菌群變化情況，不能明確抗精神病藥物對腸道菌群有何影響。后續需要擴大樣本量，納入患者詳細的臨床信息，盡可能控制干擾因素進行縱向深入研究；針對首發未用藥患者進行長期隨訪，研究用藥前后患者腸道菌群變化情況；對關鍵菌株進行分離和鑒定，并通過疾病動物模型等研究其在精神分裂癥中的潛在作用機制。