低劑量伽瑪刀照射對癲癇大鼠皮層及海馬NMDA受體亞基表達的影響☆

李衛泊尹昱 梁傳棟 呂佩源 趙振彪 董長征

目前認為，興奮性遞質與抑制性遞質失衡是癲癇的發病機理之一。N-甲基-D-天氡氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體作為一種重要的興奮性氨基酸受體，因可介導Ca2+內流引起神經細胞遲發性損傷，在癲癇發病和腦損傷機制中起著重要作用[1]。伽瑪刀作為不開顱治療顱內病變的重要手段，已用于難治性癲癇的治療，但確切的生物學機制尚不明確。本研究旨在觀察低劑量伽瑪刀照射后癲癇大鼠皮層及海馬NMDA受體亞基NR1、NR2A和NR2B的表達變化，以期探討伽瑪刀治療癲癇的可能機制，為臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與癲癇模型制備實驗動物選用雄性Wistar大鼠，根據動物是否應用藥物戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）致癇及接受伽瑪刀照射，將60只大鼠隨機分為4組，每組各15只：①對照組；②伽瑪刀組：大鼠單純接受伽瑪刀照射，不致癇；③藥物致癇組：大鼠經腹腔注射PTZ致癇；④伽瑪刀+藥物組：PTZ致癇大鼠再經伽瑪刀照射。大鼠按35 mg/kg經腹腔注射PTZ溶液制備癲癇模型，每24 h注射1次，連續注射4周，非致癇組大鼠腹腔注射同等容量相同次數的生理鹽水。

大鼠癇性發作嚴重程度采用修正Racine六級評價標準進行評價[2]，每次注射后觀察并記錄各組大鼠出現癇性發作的強度。在PTZ連續注射期間內至少出現連續3次的Ⅳ級以上的癇性發作視為完全點燃，只有完全點燃的大鼠用于后續的研究，此后仍每周腹腔注射1次相同劑量的PTZ以維持發作。

實驗大鼠于注射PTZ 3～6次后出現癇性發作，如眨眼、節律性咀嚼、點頭、甩尾、前肢陣攣、全身肌陣攣、跌倒等表現，每次于注射后3～5 min出現，每次發作持續約40～60 min后逐漸緩解。24只大鼠于注射12～16次后達到完全點燃標準，癲癇模型制備成功率為80%。其余6只在PTZ連續注射期間內未達到完全點燃，將其剔除出后續的實驗。

1.2 低劑量伽瑪刀照射于PTZ連續注射4周，癲癇模型制備成功后，應用Leksell伽瑪刀系統（ELEKTA，瑞典）對實驗大鼠進行低劑量伽瑪刀照射，將大鼠麻醉后置于動物固定架及伽瑪刀的Leksell框架上，通過核磁共振儀（GE，Signa1.5T）對大鼠進行腦冠狀面連續定位掃描，以大鼠雙側額葉為照射靶區，并根據核磁圖像在Gamma Plan系統上確定雙側額葉的坐標軸，然后按所定坐標將動物固定架安放在伽瑪刀定位架上，以50%等劑量曲線包裹靶區，邊緣劑量為15 Gy，用4 mm準直器對大鼠腦組織進行照射[3]。

1.3 免疫組織化學檢測各組大鼠于伽瑪刀照射后12周（對照組8只，伽瑪刀組8只，藥物致癇組6只，伽瑪刀+藥物組6只），常規灌注取腦、包埋、切片，采用SP法進行免疫組化染色。每組選取對應斷面的腦切片，光鏡下觀察額葉皮層和海馬區域NR1、NR2A、NR2B 免疫反應陽性細胞（NR1、NMDAR2A及NMDAR2B單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司）的形態和分布，利用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析，分別計算額葉和海馬CA1和CA3區相同面積內陽性細胞數，并對陽性細胞進行平均吸光度值測定。

1.4 蛋白免疫印跡檢測各組大鼠分別于伽瑪刀照射后12周（對照組7只，伽瑪刀組7只，藥物致癇組6只，伽瑪刀+藥物組6只），常規斷頭取腦，留取額葉皮層及海馬組織，提取總蛋白，-80℃保存備用。通過蛋白免疫印跡法檢測NMDA受體亞基 NR1、NR2A、NR2B 的蛋白表達情況（NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B單克隆抗體及β-Actin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司）。應用BAND SCAN圖像分析軟件對蛋白電泳條帶的灰度值進行測定，將各目標條帶與內參照β-actin條帶進行灰度比較，進行半定量分析。

1.5 統計學方法應用SPSS 21.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，進一步兩組間比較采用SNK法；非正態分布資料采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠行為學及癲癇發作觀察對照組及伽瑪刀組大鼠無癇性發作表現，行為正常。藥物致癇組大鼠點燃后每周再次注射PTZ后，絕大部分可出現Ⅳ級以上發作。伽瑪刀+藥物組大鼠經低劑量伽瑪刀照射后，隨觀察時間的延長，與藥物致癇組相比，每周再次注射PTZ，發作程度逐漸減輕，于照射后12周時，發作癥狀明顯減輕 （Z=-2.27，P＜0.05，表 1）。

2.2 大鼠額葉及海馬NR1、NR2A、NR2B免疫反應陽性神經元觀察大鼠額葉皮層及海馬區域均可見散在分布的 NR1、NR2A、NR2B免疫反應陽性神經元，其中對照組及伽瑪刀組在額葉皮層及海馬 CA1、CA3 區，NR1、NR2A、NR2B 陽性神經元胞漿呈棕黃色，胞體較大，可見突起。而藥物致癇組皮層及海馬 CA1、CA3 區 NR1、NR2A、NR2B 免疫反應陽性神經元數目明顯增多 （NR1：F額葉＝10.47，FCA1＝12.75，FCA3＝16.93；NR2A：F額葉＝13.40，FCA1＝10.56，FCA3＝18.28；NR2B：F額葉＝11.26，FCA1＝10.09，FCA3＝8.44；P＜0.05），胞漿染色較深，樹突減少、甚至消失，平均吸光度值均明顯增加（NR1：F額葉＝25.02，FCA1＝7.27，FCA3＝10.71；NR2A：F額葉＝16.62，FCA1＝9.10，FCA3＝30.39；NR2B：F額葉＝11.96，FCA1＝14.28，FCA3＝32.56；P＜0.05）。伽瑪刀+藥物組反應陽性神經元數目及形態接近對照組 （圖1～3和表 2～4）。

圖1 NR1在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達情況（IHC，×400）。（A）對照組；（B）伽瑪刀組；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪刀+藥物組

2.3 大鼠額葉及海馬NMDAR亞基免疫蛋白印跡結果結果顯示，與對照組比較，藥物致癇組大鼠額葉皮層及海馬NR1、NR2A和NR2B表達均明顯增強；與藥物致癇組比較，伽瑪刀+藥物組額葉皮層及海馬NR1、NR2A和NR2B表達均明顯減少（NR1：F額葉＝35.60，F海馬＝19.68；NR2A：F額葉＝44.39，F海馬＝39.31；NR2B：F額葉＝50.26，F海馬＝47.70；P＜0.05），伽瑪刀與對照組無明顯差別（圖 4及表 5）。

表1 兩組大鼠癇性發作程度（只）

3 討論

谷氨酸是中樞神經系統中介導快速興奮性突觸反應的重要神經遞質，其受體分為離子型和代謝型兩大類，其中離子型的NMDA受體主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、紋狀體、小腦及腦干的突觸后膜上，是由NR1、NR2和NR3不同亞單位組成的異聚體。NR1亞基是基本功能亞單位，NR2、NR3亞基為調節亞單位，其中NR2有NR2A、NR2B、NR2C、NR2D亞型，在很大程度上決定了該受體的性質。研究表明，NMDA受體的激活是維持神經系統正?；顒拥那疤?，在突觸傳遞和神經可塑性等生理過程中扮演關鍵角色，而NMDA受體過度的激活則可能與多種病理過程密切相關[3]。越來越多的資料顯示，NMDA受體介導的興奮性毒性在癲癇的發病過程中起重要的作用[4]。NMDA受體拮抗劑不但可以阻止癲癇的產生，還可以抑制由于癲癇而導致的大腦結構的改變[5]。此外，NMDA受體被認為是學習和記憶的關鍵物質，LTP的產生依賴于突觸前膜谷氨酸等興奮性遞質的釋放和突觸后膜NMDA受體的激活。近年研究發現，NMDA受體可能在認知功能中具有雙向作用，并與癲癇后認知功能損害有關。

圖2 NR2A在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達情況（IHC，×400）。 （A）對照組;（B）伽瑪刀組;（C）藥物致癇組;（D）伽瑪刀+藥物組

圖3 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達情況（IHC，×400）。（A）對照組；（B）伽瑪刀組；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪刀+藥物組

圖4 NR1，NR2A和NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達（免疫蛋白印跡法，β-actin為內參蛋白）。（A）對照組；（B）伽瑪刀組；（C）藥物致癇組；（D）伽瑪刀+藥物組

本研究發現，與正常大鼠相比，癲癇大鼠額葉皮層及海馬區域NMDA受體亞基NR1、NR2A及NR2B蛋白表達均顯著升高。課題組前期基礎及臨床研究發現，反復癲癇發作可導致廣泛的認知功能障礙[6-7]，因此，本研究提示，PTZ誘發癲癇的機制可能與PTZ提高腦組織 NR1、NR2A及NR2B亞單位蛋白的過度表達而改變NMDA受體的功能有關，而NMDA受體功能的變化可能是導致癲癇后出現認知功能障礙的原因之一。

表2 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR1免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

表2 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR1免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪刀藥物致癇組伽瑪刀＋藥物組8 8 6 6額葉1 3.7 5±3.2 8 1 4.1 3±2.6 4 2 2.3 3±3.2 7 1)1 7.6 7±3.6 1 2)免疫陽性神經元數C A 1 1 9.7 5±3.3 7 2 0.1 2±3.2 7 2 9.5 0±2.5 9 1)2 3.5 0±3.6 2 2)C A 2 1 7.6 2±3.6 7 1 8.6 3±2.9 7 2 9.1 7±3.1 9 1)2 1.6 7±3.0 8 2)額葉0.2 1±0.0 3 0.2 2±0.0 3 0.3 3±0.0 3 1)0.2 5±0.0 3 2)平均吸光度值C A 1 0.3 2±0.0 4 0.3 1±0.0 4 0.4 1±0.0 5 1)0.3 4±0.0 3 2)C A 2 0.2 7±0.0 5 0.2 8±0.0 4 0.3 9±0.0 4 1)0.3 0±0.0 4 2)

表3 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR2A免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

表3 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR2A免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪刀藥物致癇組伽瑪刀＋藥物組8 8 6 6額葉1 2.7 5±2.9 6 1 3.3 8±2.8 3 2 1.8 3±3.1 3 1)1 6.3 3±2.7 3 2)免疫陽性神經元數C A 1 1 4.5 0±3.2 1 1 5.6 2±2.8 8 2 3.3 3±2.7 3 1)1 7.6 7±3.5 6 2)C A 3 1 2.6 2±2.8 3 1 4.2 5±4.7 7 2 5.3 3±3.5 6 1)2 1.8 3±3.1 9 2)額葉0.2 0±0.0 3 0.2 1±0.0 3 0.3 2±0.0 4 1)0.2 4±0.0 4 2)平均吸光度值C A 1 0.2 5±0.0 5 0.2 7±0.0 4 0.3 7±0.0 5 1)0.3 0±0.0 4 2)C A 3 0.2 2±0.0 3 0.2 3±0.0 4 0.3 8±0.0 4 1)0.2 7±0.0 3 2)

表4 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR2B免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

表4 各組大鼠額葉皮層及海馬CA1和CA3區NR2B免疫陽性神經元數及平均吸光度值（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n對照組伽瑪刀藥物致癇組伽瑪刀＋藥物組8 8 6 6額葉1 3.5 0±3.0 7 1 4.7 5±3.2 8 2 2.5 0±2.5 9 1)1 7.1 7±3.1 3 2)免疫陽性神經元數C A 1 1 6.7 5±2.9 2 1 6.5 0±2.6 2 2 5.1 7±3.5 4 1)1 9.5 0±4.0 9 2)C A 2 1 4.2 5±3.1 1 1 5.7 5±3.8 8 2 4.1 7±4.8 8 1)1 8.3 3±3.6 7 2)額葉0.2 1±0.0 4 0.2 2±0.0 3 0.3 3±0.0 6 1)0.2 5±0.0 4 2)平均吸光度值C A 1 0.2 3±0.0 4 0.2 4±0.0 4 0.3 6±0.0 6 1)0.2 8±0.0 3 2)C A 2 0.2 0±0.0 2 0.1 9±0.0 3 0.3 5±0.0 5 1)0.2 3±0.0 4 2)

表5 免疫蛋白印跡法檢測NR1,NR2A和 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達（±s）

表5 免疫蛋白印跡法檢測NR1,NR2A和 NR2B在各組大鼠額葉皮層和海馬的表達（±s）

1） 與對照組比較，P＜0.05；2）與藥物致癇組比較，P＜0.05

組別n N R 1 N R 2 A N R 2 B對照組伽瑪刀藥物致癇組伽瑪刀＋藥物組7 7 6 6額葉0.6 8±0.1 0 0.6 4±0.0 6 1.2 6±0.1 5 1)0.7 8±0.1 6 2)海馬0.8 5±0.1 0 0.9 1±0.0 9 1.4 2±0.2 5 1)1.1 5±0.1 2 2)額葉0.5 5±0.1 0 0.6 1±0.1 1 1.2 3±0.1 2 1)0.7 2±0.1 3 2)海馬0.7 3±0.0 9 0.7 2±0.0 7 1.3 5±0.1 5 1)0.8 1±0.1 5 2)額葉0.6 3±0.0 5 0.7 5±0.0 8 1.3 7±0.1 9 1)0.9 1±0.1 1 2)海馬0.8 7±0.0 9 0.8 1±0.0 8 1.4 5±0.1 1 1)1.0 2±0.1 4 2)

自上世紀中葉Leksell提出放射神經外科的概念以來，伽瑪刀逐漸成為不開顱治療顱內病變的重要手段，具有安全，定位精確，對周圍組織損傷小等優點，已用于難治性癲癇的治療，但目前伽瑪刀抗癇的作用機制仍不十分清楚，限制了治療的進一步優化。有研究表明[8]，低劑量伽瑪刀照射治療癲癇的機制可能與增加致癇灶抑制性神經遞質的含量，減輕癲癇發作后的氧化應激損傷以及神經細胞凋亡有關；還有學者認為，低劑量伽瑪刀可阻滯癲癇神經元的突觸傳導，降低癲癇神經元自身活性而不會引起正常神經元壞死，從而使癲癇發作得到有效控制。本研究發現，癲癇大鼠經邊緣劑量15Gy的低劑量伽瑪刀照射后，癇性發作明顯減少，且伴有額葉皮層和海馬NR1、NR2A和NR2B表達降低。同時，我們前期研究發現，癲癇大鼠經低劑量伽瑪刀照射后，認知功能也得以改善，提示NMDA受體亞基的表達變化在低劑量伽瑪刀抗癲癇治療和改善認知功能的過程中可能發揮了重要作用，但其具體作用機制有待進一步闡明。