MiR-206在梅山豬卵巢中的表達(dá)及其靶基因的生物學(xué)信息分析

褚顏姣

摘 要 本研究探討miRNA-206在梅山豬不同直徑卵巢中的表達(dá)，利用Targetscan 6.2進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，得出其靶基因總數(shù)為588個(gè)，主要有抗藥蛋白、溶血磷脂酸受體5、冠蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白等，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行KEGG 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，采用Cytoscape3.0及其插件KEGGscape插件，獲得靶基因功能富集通路圖。結(jié)果表明：其靶基因功能富集在細(xì)胞通訊連接、定位調(diào)控、刺激反應(yīng)和發(fā)育過程等生物學(xué)功能，蛋白結(jié)合、結(jié)合酶、核酸結(jié)合等分子功能，細(xì)胞連接和核控等細(xì)胞組分；KEGG通路則顯著富集于蛋白定位、蛋白轉(zhuǎn)移等信號(hào)通路中。

關(guān)鍵詞； miR-206； 卵巢；生物學(xué)信息；梅山豬

微小RNA是一類非編碼、內(nèi)源性的短小RNA，存在于真核細(xì)胞當(dāng)中，具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)特征，其作用機(jī)制是通過與靶mRNA 的3′端非翻譯區(qū)（UTR）完全或不完全配對(duì)從而降解靶mRNA 或抑制mRNA 的正常翻譯， 進(jìn)而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。卵巢是動(dòng)物體內(nèi)重要的生殖器官之一，對(duì)動(dòng)物生殖調(diào)控過程具有重要影響。本研究關(guān)注miR-206在卵巢中的表達(dá)將對(duì)分子水平的人類配子的發(fā)育機(jī)制有更清晰的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也將為生殖醫(yī)學(xué)發(fā)展提供新動(dòng)力。[1]

1 材料與方法

1.1 梅山豬卵巢卵泡獲取

從梅山豬保種基地獲取成年梅山豬卵巢，應(yīng)用40℃ PBS漂洗，依據(jù)卵泡大小進(jìn)行分類，將獲得的卵泡存放于-80℃冰箱凍存，待用。

1.2 卵泡總RNA提取

（1） 將lml的Trizol加入lml離心管中。

（2） 各取300-500mg不同直徑卵泡置入低溫下的陶瓷碾碾成粉末，將粉末迅速轉(zhuǎn)入上述離心管中，混合均勻。

（3） 加入0.2ml氯仿，蓋緊，劇烈震蕩30s，室溫下放置5min。

（4） 4℃、12000r/min離心10min后，取上層水相溶液，轉(zhuǎn)入新離心管中，避免接觸下兩層液體。

（5） 在得到的上清液中加入等體積的異丙醇混勻，冰上放置 15min。

（6） 將所得溶液，4℃、12000rpm離心10 min，離心后管底及側(cè)壁有RNA沉淀。

（7） 移去上清液，用1ml、75%乙醇清洗 RNA沉淀，震蕩 30s，4℃、12000rpm離心 2min，棄上清。

（8） 快速離心1min，去除殘余液體，RNA沉于管底。

（9） 室溫放置超凈臺(tái)風(fēng)干10分鐘，將沉淀物晾干后溶于20μl DEPC水中，-80℃保存。

1.3 RNA濃度、純度和完整性的測(cè)定

取樣檢測(cè) RNA 濃度，將取提后總 RNA稀釋 20 倍，紫外分光光度計(jì)，測(cè)定參數(shù)設(shè)定為 RNA，在比色皿中加入 100ul 的RNase-free ddH2O 校正調(diào)零，檢測(cè)樣本OD260/280 比值及濃度。

1.4 miR-206熒光定量PCR

1.4.1合成cDNA

Total RNA 1.0ug 無RNA酶水至20ul， 總體積20ul。

（1） 冰上預(yù)冷的RNase free的離心管，準(zhǔn)備RT master mix；

（2） 混勻上述溶液，2000rpm離心2min；

（3） 搖勻，冰上放置5min；

（4）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件，16℃，30min；42℃，42min；85℃，5min；將以上產(chǎn)物放在冰上待用或-20℃保存。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

所有cDNA樣品分別配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系；

輕彈管底將溶液混合，5000 rpm 短暫離心，將 PCR 反應(yīng)溶液置于 Real-time PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。[2]

1.5 miR-206靶基因預(yù)測(cè)

將獲得的豬miR-206，利用Targetscan 6.2進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，得到有關(guān)miRNA-206的靶基因總數(shù)。

1.6 miR-206生殖相關(guān)靶基因 Gene Ontology 分析

Gene Ontology分析利用Cytoscape 3.0及其插件BiNGO ，從而對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析。根據(jù)GO 注釋中的分子功能 、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分等應(yīng)用選項(xiàng)，用BiNGO 進(jìn)行相應(yīng)GO注釋顯著性分析。

1.7 KEGG 通路分析及KEGG通路圖

針對(duì)預(yù)測(cè)出的miR-206的生殖相關(guān)靶基因，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，采用Cytoscape 及其插件KEGGscape插件獲得靶基因功能富集通路圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用ANOVA檢驗(yàn)對(duì)GO分析及KEGG通路分析中數(shù)據(jù)間差異進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 miR-206在梅山豬卵巢中的表達(dá)

miR-206在不同直徑的卵巢中表達(dá)存在差異，在直徑為1.5-3mm的卵巢中相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，在直徑為3-5mm的卵巢中相對(duì)表達(dá)量差異顯著，在直徑≥5mm的卵巢中相對(duì)表達(dá)量極顯著。

2.2 miR-206靶基因預(yù)測(cè)

結(jié)果顯示，miR-206的靶基因數(shù)共588個(gè)基因，主要有抗藥蛋白、溶血磷脂酸受體5、冠蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白等。

2.3 miR-206 生殖相關(guān)靶基因Gene Ontology 分析

將上述miR-206與生殖有關(guān)的靶基因輸入到Cytoscape 3.0及其插件BiNGO中，GO注釋miR-206與生殖有關(guān)的靶基因涉及到的生物學(xué)過程，結(jié)果表明：其靶基因功能富集在細(xì)胞通訊連接、定位調(diào)控、刺激反應(yīng)和發(fā)育過程等生物學(xué)功能，蛋白結(jié)合、結(jié)合酶、核酸結(jié)合等分子功能，細(xì)胞連接和核控等細(xì)胞組分。

2.4 KEGG 通路分析及KEGG通路圖

對(duì)與miR-206生殖有關(guān)的靶基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示，靶基因富集于蛋白定位、蛋白轉(zhuǎn)移等相關(guān)通路。

3 討論

本研究探討了MiR-206在不同直徑卵巢中的表達(dá)，研究所得出的結(jié)果顯示了miR-206在卵巢中的作用，這對(duì)于進(jìn)一步研究miR-206與卵巢功能的關(guān)系具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，幫助人們更好的理解了哺乳動(dòng)物生殖內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制，為提高哺乳動(dòng)物繁殖力和探尋更科學(xué)的生殖調(diào)控途徑提供了新的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鐘凱、王月影、朱河水.microRNA在調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育和乳腺免疫功能中的作用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（5）：164-166

[2] CroceC M， Calin G A， miRNAs， cancer， and stem cell division[J]. cell，2005，122（1）：6-7