小麥真菌結構分析及其與嘔吐毒素含量的關系

戴寶玲 楊華 戴賢君

摘要：旨在闡明污染小麥的真菌的結構組成并分析污染小麥的真菌與麥粒中嘔吐毒素（DON）濃度之間的關系。采用高效液相色譜法（HPLC）測定麥粒中的DON含量，選取DON濃度為高、中、低[DON含量分別為（2 982±1 534）、（972±251）、（42±1） μg/kg]的小麥樣品各12份，抽提3組小麥微生物DNA進行真菌測序。結果表明，通過基因組DNA提取、高通量測序、生物信息學分析后，共得到820個運算分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）?；诓煌诸愃降姆治隹芍?，其優勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota），平均相對豐度分別為46964 0%、0.722 1%;優勢菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），分別占16.987 9%、5.570 1%。3組小麥中的真菌物種數量有顯著差異（P<0.05）。由研究結果可知，小麥中存在一定的病原真菌污染，如鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢屬（Botrytis），有必要對攜帶真菌毒素DON小麥中的真菌結構進行檢測，并分析兩者間的關系。

關鍵詞：小麥;高效液相色譜;嘔吐毒素;高通量測序;菌群結構

中圖分類號： S432.4+4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0228-05

小麥是三大谷物之一，是一種在世界各地被廣泛種植的禾本科植物，起源于中東新月沃土地區，是世界上人們最早栽培的農作物之一，其營養豐富，經濟價值較高[1]。作為我國重要的糧食作物，小麥的種植區域非常廣闊，北到黑龍江，南到海南島[2]。但是由于受到地理位置及氣候的影響，一些地區所產小麥會受到真菌污染，徐文靜等于2015年對安徽省5個地級市小麥的真菌污染情況進行調查發現，其污染率為100%[3]。真菌在適宜的條件下可能會產生有毒的代謝產物——真菌毒素，目前研究發現的300多種真菌毒素中約有20種對人類和動物有確定的毒性作用[4]。其中脫氧血腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，簡稱DON），又稱嘔吐毒素，是小麥中常見的污染真菌毒素，DON毒性較穩定，在加工過程中也很難將其毒性破壞，進入食物鏈后，會對人畜的健康造成一定的威脅[5]。因此，有必要對小麥嘔吐毒素和真菌污染情況進行調查，并分析兩者之間的關系。高效液相色譜法具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應用范圍廣的“四高一廣”特點，可以用此方法檢測小麥樣品中嘔吐毒素的含量。高通量測序技術的出現克服了一些試驗技術具有的通量低、信息量小、成本高的缺陷[6]，隨著其快速發展，目前已經成為微生物群落研究中非常重要的工具[7]。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 樣品來源與試驗設計 取浙江省2016年產小麥，依據嘔吐毒素含量分成高（H）、中（M）、低（L）3組，每組12份樣品，用于分析其中的真菌結構，小麥嘔吐毒素H、M、L組平均含量分別為（2 982±1 534）、（972±251）、（42±1） μg/kg。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;熒光分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司;Illumina測序儀，Illumina公司;PCR擴增儀，德國Biometra公司。

1.2 DNA的提取及擴增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM（Zymo Research）對小麥的DNA進行提取。用2%瓊脂糖凝膠電泳進行進一步檢測。以提取的DNA為模板，用ITS2引物 ITS3-2024F （5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）和ITS4-2409R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對小麥真菌DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，簡稱ITS）測序分析。

1.3 DNA測序和質量控制

用熒光分光光度計測得提取的DNA濃度，選取濃度在40～100 ng/μL、D260 nm/280 nm在1.8～2.0之間的DNA，用Illumina Hiseq平臺高通量技術進行測序。

1.4 生物信息學分析

采用Illumina測序技術對小麥中真菌ITS的ITS2區域進行掃描測序，得到的圖像數據經Base Calling轉化為序列數據，再用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V 1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）對序列進行質控和過濾，得到高質量的DNA序列[8-9]。根據相似性≥97%的原則將通過質控的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）[10]，基于OTU聚類分析結果，進行香農指數分析，基于分類學信息，分別在門、屬水平上進行小麥真菌菌群結構的統計與分析。

1.5 統計分析

采用SPSS統計軟件進行方差分析（ANOVA），來比較不同DON濃度的小麥真菌相對豐度的差異，對有顯著性差異的處理進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 小麥中真菌物種的豐度及多樣性

通過小麥基因組DNA提取、高通量測序、生物信息學分析后共得到820個OTUs，根據相似性≥97%的原則，以抽取的序列數與它們所能代表的OTU數構建曲線，即稀釋性曲線（rarefaction curve）[11]，繪制的曲線均趨于平緩（圖1），說明小麥樣品測序數據量合理，能夠覆蓋小麥中的所有真菌并能真實反映物種的多樣性組成。

2.2 基于門、屬水平對小麥上攜帶的真菌群落結構的分析

2.2.1 門水平的小麥真菌群落結構分析 從微生物分類門的水平可知，本研究收集的小麥樣品中主要包含子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、纖毛亞門（Ciliophora）、接合菌門（Zygomycota）和球囊菌門（Glomeromycota）等。其中子囊菌門、擔子菌門是小麥真菌的優勢菌門，均100%被檢出，其相對豐度分別為46.9640%（變化范圍為12.399 6%～82.496 1%）、0.722 1%（變化范圍為0.103 2%～1.877 3%），詳見表1。

2.2.2 屬水平的小麥真菌群落結構分析 從屬的水平上分析可知，小麥中真菌最大豐度排名前35的屬中，17個真菌屬在小麥中100%被檢出，檢出率>90%的真菌屬有24個，其中優勢菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），平均相對豐度分別為16.987 9%、5.570 1%，中位數分別為4.634 2%（變化范圍為2.634 6%～41.050 2%）和2.358 6%（變化范圍為0.778 6%～16.341 4%），詳見表2。

2.3 基于門、屬水平對小麥中真菌和DON關系的分析

2.3.1 樣品測序概況 測序后進行菌群結構的多樣性分析，由圖2可以看出，3種不同濃度DON處理的小麥樣品平均分別獲得（131±23）、（117±13）、（118±13）個OTUs，其中H組小麥真菌的物種數量與M、L組有顯著差異（P<0.05）;菌群多樣性指數（香農指數）在3組間無顯著差異（圖2）。

2.3.2 基于門水平對小麥中真菌相對豐度和DON關系的分析 從門的水平上分析可知，小麥中高濃度DON組（H組）的子囊菌門、擔子菌門的平均相對豐度分別為（40.287 8±9.067 9）%、（0.688 6±0.035 3）%，均低于中濃度DON組（M組）的（51.784 4±3.170 1）%、（0.755 7±0.069 2）%和低濃度DON組（L組）的（48.819 9±49.052 0）%、（0.722 0±0.427 2）%。H組和M組的子囊菌門相對豐度有顯著差異（P<0.05）;纖毛亞門、接合菌門和球囊菌門的相對豐度在3組間均無明顯差異，詳見圖3。

2.3.3 基于屬水平對小麥中真菌相對豐度和DON關系的分析 如圖4所示，從屬水平上分析可知，小麥中真菌最大豐度排名前35的屬中，前12個屬中鏈格孢屬的豐度相對較高，L組的平均相對豐度為（22.573 2±2.126 9）%，高于M組[（19.448 2±4477 9）%]、H組[（8.942 4±1.708 7）%]組，H組鏈格孢屬與L、M組間均有顯著差異（P<0.05）。附球菌屬的平均豐度次之，L組與M、H組間均有顯著差異（P<0.05）。此外，本研究的檢測結果顯示，存在一定量葡萄孢屬、鐮刀菌屬的病原真菌。Monographella、隱球菌屬、曲霉屬、短梗霉屬、擲孢酵母屬、Pyrenophora和匍柄霉屬的相對豐度在3組間均無明顯差異。

2.4 小麥樣品的主坐標分析

根據3組中各個小麥樣品的OTU計算樣品間的加權UniFrac距離，再進行主坐標分析（PCoA）。由圖5可見，PCo1、PCo2分別解釋了17.78%、10.67%的差異性。各處理樣可以分為2個大集合，可以很明顯地看出，L組與H、M組間的差異較大，H組和M組可視為一簇，即污染毒素濃度低的小麥中的真菌菌群豐度（L組）與污染毒素高的小麥中的真菌菌群豐度（H組和M組）存在差異。小麥中的嘔吐毒素與其真菌菌群豐度呈一定的相關性。

3 討論

嘔吐毒素是一種真菌毒素，主要分布在谷物中，尤其是小麥中，人和動物長期大量食用被DON污染的小麥后會抑制蛋白質的合成，導致嘔吐、腹瀉、厭食、神經紊亂等毒性效應[12-14]。因此，被DON污染的小麥存在一定的膳食風險，應進一步對小麥進行真菌菌群結構的研究分析。

基于分類學門的水平上分析可知，小麥樣品中子囊菌門和擔子菌門為優勢菌門，這與史亞千等的研究結果[15]相符。子囊菌門、擔子菌門真菌屬于病原真菌，研究發現，有些土壤真菌可能引起植物病害、影響作物產量甚至導致植物死亡[16]。張敏等對小麥根際土壤真菌群落結構進行分析發現，子囊菌門和擔子菌門為優勢菌門[17]，說明土壤可能是小麥污染病原真菌導致其病害的原因之一。

基于分類學屬水平的分析顯示，小麥樣品中的鏈格孢屬和附球菌屬為優勢菌屬。鏈格孢屬真菌是一類廣泛分布在自然界中的真菌，除了可引起農作物病變外，還可使農產品腐爛變質，并危及農產品的食用安全[18]。有些鏈格孢屬真菌還具有一定的產毒能力，是農作物的主要致病菌之一，人或動物一旦攝入被鏈格孢毒素污染的食物，可能導致急性或慢性中毒，某些鏈格孢毒素還有致畸、致癌、致突變作用[19]。從小麥中檢測發現的葡萄孢屬真菌屬于一種廣泛分布的植物病原真菌[20]，此外，在許多不同的寄主上發現了許多葡萄孢新種[21-23]，它們可導致多種作物灰霉病的發生。鐮刀菌屬和其有性階段的赤霉屬均被檢出，都可產生DON，它們都是具有破壞性的植物病原真菌，可引起小麥的赤霉病。

4 結論

本研究用高效液相色譜法測定了36份麥粒中的DON含量。通過基因組DNA 提取、高通量測序、生物信息學分析后共得到820個OTUs?；诓煌诸愃降姆治隹芍?，小麥中的優勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota），其平均相對豐度分別為46.964 0%、0.722 1%。優勢菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、附球菌屬（Epicoccum），分別占16.987 9%、5.570 1%?？梢钥闯?，小麥中存在一定的病原真菌污染，應引起重視。

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