阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導促進乳腺癌TAM向M1表型極化

何少忠（通信作者），毛亞婷，王群，廖桂祥（通信作者）

1 深圳市寶安區中心醫院腫瘤科 （廣東深圳 518102）；2 桂林醫學院附屬醫院腫瘤科 （廣西桂林541004）；3 深圳市人民醫院放療科 （廣東深圳 518020）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率居女性惡性腫瘤首位。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）是外周血單核細胞遷移浸潤到腫瘤組織的巨噬細胞，是乳腺癌免疫微環境中最豐富的免疫細胞，在促進乳腺癌進展與免疫逃逸中發揮關鍵的橋梁作用[1-5]。根據TAM活化類型及其在腫瘤微環境中作用不同，主要分為兩種極化類型，即經典活化M1型和替代活化M2型，M1型主要誘導Th1型免疫應答，產生細胞毒作用殺傷腫瘤；M2型主要誘導Th2型免疫應答，抑制炎癥促進腫瘤生長[6-9]。VEGF/VEGFR-2信號通路在腫瘤血管生成中起關鍵作用，有研究報道VEGF促進巨噬細胞遷移募集到腫瘤組織形成TAM，而VEGF/VEGFR-2信號通路是否參與TAM的極化表型調控[10-13]。本研究試想通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導，以促進乳腺癌TAM向M1表型極化，促進炎癥反應。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞

小鼠乳腺癌4T1細胞及小鼠單核細胞-巨噬細胞RAW264.7（中科院上海細胞庫），4T1細胞使用含10%滅活胎牛血清的PRMIl640培養基進行培養和傳代，RAW264.7細胞使用含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養基進行培養和傳代。

1.1.2 主要試劑

細胞培養基RPMI 1640、細胞培養基DMEM、胰蛋白酶EDTA消化液、胎牛血清（FBS）及無血清Opti-MEMI培養基（美國Gibco公司），小鼠細胞因子（IL-10、IL-12、VEGF、ELISA、TGF-β）檢測試劑盒（美國Invitrogen公司），Alexa Fluor? 488 anti-mouse CD206、PerCP anti-mouse F4/80、APC anti-mouse CD16/32抗體（美國Ebioscience公司），慢病毒（賽業生物），阿帕替尼（江蘇恒瑞公司），貝伐單抗（上海羅氏公司）。

1.2 方法

1.2.1 誘導鑒定TAM細胞模型，檢測VEGFR-2蛋白表達

將小鼠乳腺癌細胞4T1細胞接種于25 cm2培養瓶中，加入適量完全培養基，細胞培養24 h后，收集培養液并用0.22 μm過濾器過濾得到4T1細胞上清液。將RAW264.7細胞細胞接種于25 cm2培養瓶中，長到60%～70%底面積時，棄掉原來培養液，加入4T1細胞上清液繼續培養48 h，誘導形成TAM細胞。流式細胞術檢測誘導前后TAM表型，ELISA檢測誘導前后細胞因子的變化和WB檢測誘導前后VEGFR-2蛋白表達。

1.2.2 阻斷VEGF/VEGFR-2 信號傳導對TAM表型的干預實驗

取處于對數生長期的RAW264.7細胞，加入4T1細胞上清液培養48h后，誘導形成TAM細胞。與未干預TAM組對比，設4個TAM干預組，分別為VEGFR-2基因siRNA組、VEGF抗體（貝伐單抗）阻斷組、VEGFR-2受體抑制劑（阿帕替尼）阻斷組、貝伐單抗+阿帕替尼聯合阻斷組。VEGFR-2基因siRNA組用慢病毒轉染TAM細胞沉默VEGFR-2的表達，貝伐單抗組和阿帕替尼組分別用20 μg/ml貝伐單抗和8 nM阿帕替尼作用24 h，貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯合干預組則聯用20 μg/ml貝伐單抗+8 nM阿帕替尼處理24 h。收集細胞后流式細胞術檢測TAM表型、ELISA檢測細胞因子的變化和WB檢測VEGFR-2表達，明確阻斷VEGF/VEGFR-2 信號傳導對TAM表型的影響。

1.2.3 TAM遷移實驗

將1.2.2各組處理后細胞用胰酶消化細胞成單個細胞，加入transwell小室上室，下室加入培養液，放入37 ℃培養箱中培養48 h，取出上室用固定液固定20 min，將膜取下結晶紫染色，封片，鏡下拍照。倒置顯微鏡下觀察上室外表面細胞，各取5個視野。脫色處理后在550 nm處酶標儀測定吸光度（OD）值，與未干預TAM組對比，檢測4個干預阻斷組TAM侵襲能力的改變。

1.2.4 TAM吞噬實驗

將1.2.2各組處理后細胞棄培養液培養，對照孔加0.5 ml 0.9%氯化鈉注射液，其余每孔加0.5 ml 0.075%中性紅，繼續培養1 h，傾去上清液，用PBS洗滌，每孔加入細胞溶解液，室溫下放置30 min。待細胞溶解后，即用分光光度計測定OD值，檢測未干預TAM與4個干預阻斷組TAM的吞噬能力的改變。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，所有實驗重復3次，計量資料以±s表示，率的比較采用方差分析，采用bonfernoni分析總體及總體中兩樣本均數之間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAM細胞誘導模型呈M2型極化

2.1.1 TAM細胞呈M2型極化

流式細胞術檢測小鼠乳腺癌細胞4T1培養液誘導培養RAW264.7小鼠單核細胞-巨噬細胞48 h后細胞表面分子標志的表達，M1型（表面分子標記 F4/80+CD16/32）細胞比例由誘導前12.95%降低至誘導后4.47%（P＜0.05），M2型（表面分子標記F4/80+CD206）細胞由誘導前4.44%升高至誘導后18.51%（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 流式細胞術檢測細胞誘導前后表面分子變化

表1 M1、M2型細胞誘導前后比較（%，±s）

表1 M1、M2型細胞誘導前后比較（%，±s）

注：與誘導前RAW264.7組比較，aP＜0.001

組別 M1（CD16/32+） M2（CD206+）誘導前RAW264.7組 12.95±2.61 4.40±0.62誘導后TAM組 4.47±0.50a 18.51±3.14a

2.1.2 TAM細胞分泌Th1型細胞因子減少，Th2型細胞因子分泌水平增高

M1和M2型巨噬細胞分別通過分泌Th1型細胞因子（IL-12）和 Th2型細胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β 及ARG-1）來發揮免疫調節的作用。ELISA檢測結果顯示，4T1細胞上清液誘導培養RAW264.7細胞后Th1型細胞因子（IL-12）分泌減少（P＜0.05），Th2型細胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌增多（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ELISA檢測細胞誘導前后細胞因子變化

2.2 M2型TAM高表達VEGFR-2受體

2.2.1 TAM細胞高表達VEGFR-2蛋白

Western Blot檢測經小鼠乳腺癌細胞4T1培養液誘導培養RAW264.7后VEGFR-2蛋白的表達，誘導后TAM細胞VEGFR-2蛋白含量增高（P＜0.05），是誘導前細胞的2.5倍。見圖3。

圖3 WB檢測VEGFR-2的蛋白表達

2.2.2 M2 型TAM高表達VEGFR-2蛋白受體

流式細胞術雙染檢測小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7經小鼠乳腺癌細胞4T1上清液誘導48 h后M1與M2型TAM中VEGFR-2膜蛋白的表達，M2型細胞的比例由50.1%升高到83.1%（P＜0.05），VEGFR-2蛋白在M2型細胞中的比例由33.7%上升至48.5%（P＜0.05），而VEGFR-2蛋白在M1型細胞中比例改變不明顯。見圖4和表2。

2.3 阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導能夠逆轉M2-TAM表型，促進TAM向M1極化

RAW264.7小鼠單核-巨噬細胞加入4T1細胞上清液誘導培養48h后得到TAM細胞。將上述細胞分為5組，分別為TAM空白對照組、VEGFR-2沉默組、VEGF抗體（貝伐單抗）阻斷組、VEGFR-2受體抑制劑（阿帕替尼）阻斷組和貝伐單抗+阿帕替尼聯合阻斷組。通過siRNA技術干擾TAM細胞VEGFR-2表達、VEGF抗體（貝伐單抗）、VEGFR-2受體阻斷劑（阿帕替尼）及貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯合分別阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導對TAM極化表型的影響，結果提示阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導能夠逆轉 M2-TAM表型，促進TAM向M1極化。

圖4 流式雙染檢測誘導前（RAW264.7）與誘導后（TAM）M1與M2型VEGFR-2受體表達

表2 M1、M2型VEGFR-2的誘導前后比較（%，±s）

表2 M1、M2型VEGFR-2的誘導前后比較（%，±s）

注：與誘導前RAW264.7組比較，aP＜0.05

組別 M1（CD16/32+）VEGFR-2+M1（CD16/32+）M2（CD206+）VEGFR-2+M2（CD206+）誘導前RAW264.7組 97.9±3.0 94.3±3.1 50.1±12.7 33.7±5.6誘導后TAM組 99.2±1.2 85.4±5.2 83.1±13.6a 48.5±6.1a

2.3.1 Western Blot 檢測VEGFR-2的表達

相比于空白對照組，siRNA沉默TAM細胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導導致了VEGFR-2蛋白表達水平的降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 WB檢測TAM干預前后VEGFR-2蛋白表達

2.3.2 阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導促進TAM表型向M1極化

相比于空白對照組，siRNA沉默TAM細胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導導致M1型TAM比例升高（P＜0.05），M2型TAM比例下降（P＜0.05）。見圖6和表3。

圖6 流式細胞術檢測細胞干預前后表面分子變化

表3 M1、M2型細胞干預前后比較（%，±s）

表3 M1、M2型細胞干預前后比較（%，±s）

注：與TAM空白對照組比較，aP＜0.05

組別 M1（CD16/32+） M2（CD206+）TAM空白對照組 6.23±0.58 18.36±0.91 VEGFR-2沉默組 9.78±1.25a 10.52±0.61a貝伐單抗阻斷組 9.37±0.61a 12.67±1.46a阿帕替尼阻斷組 10.71±1.00a 8.23±0.30a貝伐單抗+阿帕替尼阻斷組 10.88±0.89a 5.48±0.46a

2.3.3 阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導促進Th1型細胞因子分泌，減少Th2型細胞因子分泌

相比于TAM空白對照組，siRNA沉默TAM細胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導促進TAM表型向M1極化后，Th1型細胞因子（IL-12）分泌增多（P＜0.05），Th2型細胞因子（IL-10、VEGF、TGF-β及ARG-1）分泌減少（P＜0.05）。見圖7。

圖7 ELISA檢測TAM細胞干預前后細胞因子變化

2.4 TAM遷移實驗及吞噬實驗

Transwell結果表明，相比于TAM空白對照組，siRNA 沉默TAM細胞VEGFR-2蛋白或藥物阻斷 VEGF/VEGFR-2信號傳導促進TAM表型向M1型極化，TAM遷移能力增強（P＜0.05）（圖8a）。中性紅吞噬實驗結果提示阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導促進乳腺癌TAM向M1表型極化后，TAM細胞的吞噬能力增強（P＜0.05）（圖8b）。

圖8 TAM表型向M1型極化后

3 討論

TAM在乳腺癌浸潤免疫細胞中的比例高達50%，促進乳腺癌的發生發展，導致乳腺癌復發及預后不良，越來越受到研究人員的重視[14-16]。TAM極化表型是影響腫瘤微環境免疫狀態的重要因素[17]。腫瘤微環境中TAM主要被誘導極化為M2型，特征性表達 CD206、CD163，高表達抗炎細胞因子IL-10，低表達促炎細胞因子IL-12，分泌VEGF、TGF-β及CCL-22，產生精氨酸酶（Arg-1），誘導Th2型免疫應答，導致了免疫逃逸[18-20]。

本研究通過小鼠乳腺癌細胞4T1培養液誘導培養RAW264.7小鼠巨噬細胞，模擬腫瘤微環境，細胞實驗進一步證實TAM細胞誘導模型呈M2型極化，同時TAM細胞分泌Th1型細胞因子減少，Th2型細胞因子及VEGF分泌水平增高。

VEGF是血管內皮生長因子，VEGFR-2是VEGF的跨膜受體，由胞外區、膜區及胞內酪氨酸激酶區組成，VEGFR-2受體和VEGF配體結合從而激活催化域內酪氨酸激酶，導致受體磷酸化而引起胞內酶聯反應；介導腫瘤異常血管新生VEGF/VEGFR-2信號通路在腫瘤血管生成中起關鍵作用[21-22]。此外，有研究報道腫瘤缺氧微環境誘導VEGF表達后，將吸引巨噬細胞遷移浸潤到腫瘤組織形成TAM，且TAM自身分泌VEGF形成正反饋，刺激局部血管形成募集更多的巨噬細胞浸潤腫瘤組織[23-24]。如何打破TAM形成的免疫抑制微環境，是腫瘤免疫治療面臨的重要問題[25]。本研究通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導，以促進乳腺癌TAM向M1表型極化，促進炎癥反應。

本研究通過siRNA沉默小鼠巨噬細胞VEGFR-2基因、VEGF抗體（貝伐單抗）、VEGFR-2受體阻斷劑（阿帕替尼）及貝伐單抗+阿帕替尼藥物聯合阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導，研究對TAM極化表型功能的影響。結果顯示，阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導導致VEGFR-2蛋白表達降低后，能夠逆轉M2-TAM表型促進TAM表型向M1型極化，同時促進Th1型細胞因子分泌，減少Th2型細胞因子分泌，增強TAM的遷移、吞噬，促進炎癥反應，證實通過阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導從而促進TAM向M1型極化，對于調控腫瘤微環境中TAM表型功能具有重要意義。

綜上所述，阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導能夠逆轉M2型TAM，促進TAM向M1型極化，增強TAM遷移吞噬能力，促進炎癥反應。我們將進一步構造動物模型，開展體內研究證實阻斷VEGF/VEGFR-2信號傳導逆轉M2型TAM與T細胞活化的作用與機制。