乳腺癌T淋巴細胞和腫瘤相關巨噬細胞浸潤的臨床病理分析

何少忠（通信作者），張冬冬，王群，朱勝楠，毛亞婷，廖桂祥（通信作者）

1深圳寶安中心醫院（深圳大學第五附屬醫院）腫瘤科 （廣東深圳 518102）；2桂林醫學院附屬醫院腫瘤科 （廣西桂林 541004）；3深圳市人民醫院放療科 （廣東深圳 518020）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤,其發病率居女性惡性腫瘤首位[1]。腫瘤微環境對于乳腺癌的發生、發展有著至關重要的作用，腫瘤微環境中的T淋巴細胞和腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）備受關注。T淋巴細胞是腫瘤微環境中主要的免疫效應細胞，TAM是腫瘤免疫微環境中最豐富的免疫細胞，抑制T細胞免疫功能，在促進腫瘤進展與免疫逃逸中發揮關鍵的橋梁作用[2-3]。盡管人們對T細胞和TAM開展了廣泛的研究，但是目前少有研究報道T細胞和TAM在乳腺癌組織的浸潤與乳腺癌Ki-67表達及臨床病理的關系[3]。本研究通過收集初治乳腺癌患者術后組織標本，采用免疫組織化學方法檢測T淋巴細胞、CD68+TAM的浸潤數量和乳腺癌Ki-67的表達，探討乳腺癌組織中T淋巴細胞和CD68+TAM的浸潤與乳腺癌增殖指數Ki-67表達及臨床病理的相關意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集桂林醫學院附屬醫院2014－2018年初治乳腺癌術后石蠟組織標本45例，并與正常乳腺組織對比，乳腺癌患者術前未行放療、化療及內分泌等新輔助治療。年齡35～75歲，中位年齡51歲；腫塊直徑，24例≤3 cm，21例＞3 cm；組織學分級，Ⅰ～Ⅱ級30例，Ⅲ級15例；淋巴結轉移，25例未轉移，20例轉移；ER陰性18例，ER陽性27例；PR陰性17例，PR陽性28例；HER2陰性27例，HER2陽性18例。

1.2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗體CD3、CD68、Ki-67（美國Invitrogen公司），免疫組織化學試劑盒與辣根過氧化物酶標記型的山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物公司）。

1.3 T淋巴細胞、CD68+ TAM和Ki-67蛋白檢測

運用免疫組織化學法檢測乳腺癌組織中T淋巴細胞、CD68+TAM和Ki-67蛋白的表達。組織標本經4%的多聚甲醛固定液固定，后行脫水、石蠟包埋，4 μm連續切片。二甲苯脫蠟，再梯度乙醇水化，檸檬酸緩沖液進行抗原修復后，用3%的過氧化氫溶液浸泡10 min以消除內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，5% BSA 37 ℃恒溫箱孵育30 min。分別滴加鼠抗人CD3、CD68、Ki-67單克隆抗體（美國Invitrogen公司，工作液，無需稀釋），濕盒內室溫孵育1 h。經PBS洗3次后，滴加即用型二抗工作液，室溫20 min，PBS洗3次，采用吐溫20潤洗1次，DAB顯色。蘇木素復染，脫水封片。用已知CD3、CD68、Ki-67染色陽性的扁桃體組織切片為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 T淋巴細胞、CD68+ TAM結果判讀和計數

CD3+染色結果評估：以細胞膜上有黃色和棕黃色染色的T淋巴細胞為陽性細胞。CD68+染色結果評估：以細胞漿有黃色和棕黃色的巨噬細胞為陽性細胞。由2名病理科醫師觀察免疫組織化學切片，每個片子均在顯微鏡高倍鏡視野下（×400）隨機選取5個表達比較集中的視野，對整個區域進行計數，最后取5個視野總和的平均值；以中位值為標準分為高低表達組，高于中位值為高表達組，低于中位值為低表達組。

1.5 Ki-67的結果評估和表達測定

Ki-67表達于腫瘤細胞，胞核染色呈棕黃色。每張切片選取5個高倍視野，顯微鏡下計數1 000個腫瘤細胞，計算胞核染色細胞所占比例，取其平均值為Ki-67增殖指數，Ki-67以百分率為計量指標。

1.6 評價指標

CD3+、CD68+和Ki-67均通過免疫組化所著色的顏色強度與著色的顆粒數量來評價陽性、陰性及表達強度。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 T淋巴細胞、CD68+ TAM和Ki-67在乳腺癌中的表達

CD3+在組織切片中定位于T淋巴細胞的細胞膜，陽性細胞呈彌漫狀分布在乳腺癌癌間質，亦有呈卵圓形散在浸潤于乳腺癌癌巢（圖1）；CD68+在組織切片中定位于巨噬細胞的細胞漿，陽性細胞呈巢狀分布在乳腺癌癌間質，亦有呈星形散在浸潤于乳腺癌癌巢（圖2）。Ki-67在組織切片中定位于腫瘤細胞的細胞核，細胞呈橢圓形散在分布于乳腺癌癌巢（圖3）。

圖1 T淋巴細胞在不同乳腺組織中的表達

圖2 CD68+ TAM在不同乳腺組織中的表達

圖3 Ki-67在不同乳腺組織中的表達

2.2 乳腺癌浸潤的T淋巴細胞、CD68+ TAM與乳腺癌增殖指數Ki-67的關系

分別收集T淋巴細胞、CD68+TAM與Ki-67共3組數據，這3組數據的總體表達水平分別為（162.20±27.99）個/HPF、（87.36±10.72）個/HPF和（30.31±19.97）%（圖4）。T淋巴細胞與CD68+TAM陽性表達中位值為別為167個/HPF、86個/HPF；將T淋巴細胞數≤167個/HPF定為低表達組，T淋巴細胞數＞167個/HPF定為高表達組（圖5）；CD68+TAM數≤86個/HPF定為低表達組，CD68+TAM數＞86個/HPF定為高表達組（圖6）。

圖4 T淋巴細胞、CD68+TAM與Ki-67的總體表達水平

圖5 T淋巴細胞中位值

圖6 CD68+ TAM的中位值

T淋巴細胞浸潤高表達組與低表達組的14%、20%、30%Ki-67增值指數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；T淋巴細胞浸潤高表達組與低表達組的50%Ki-67增殖指數比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。CD68+TAM浸潤高表達組與低表達組的14%、20%、30%、50%Ki-67增值指數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CD3+T淋巴細胞、CD68+TAM浸潤與Ki-67不同增殖指數的關系

2.3 T淋巴細胞、CD68+ TAM浸潤與乳腺癌患者臨床病理參數的關系

T淋巴細胞浸潤程度與乳腺癌腫塊大小、淋巴結轉移、ER及PR有關（P＜0.05）；CD68+TAM浸潤程度與乳腺癌患者年齡、淋巴結轉移及HER2有關（P＜0.05）。見表2和圖7。

3 討論

腫瘤免疫微環境對乳腺癌的演進起了關鍵作用[2]。T淋巴細胞是腫瘤浸潤淋巴細胞的主要細胞類型，表達特異性抗原CD3，能直接殺死腫瘤細胞和糾正身體免疫功能低下，在腫瘤免疫治療中起主導作用。但是T淋巴細胞在腫瘤微環境中處于被抑制狀態，導致腫瘤浸潤T淋巴細胞減少、活性低。因此，T淋巴細胞的功能正常和數量穩定是微環境內細胞免疫功能正常發揮的首要條件[3-4]。浸潤于實體腫瘤內部和周邊的巨噬細胞被稱為TAM。TAM是外周血單核細胞遷移浸潤到腫瘤組織的巨噬細胞，是腫瘤免疫微環境中最豐富的免疫細胞，在促進腫瘤進展與免疫逃逸中發揮關鍵的橋梁作用[5]。TAM表面表達多種特異抗原，如CD68、CD163等。TAM在乳腺癌浸潤免疫細胞中的比例高達50%，促進乳腺癌的發生、發展，導致乳腺癌復發及預后不良，越來越受到研究人員的重視[6]。

表2 T淋巴細胞、CD68+TAM浸潤與乳腺癌臨床病理參數的關系

圖7 T淋巴細胞、CD68+TAM浸潤與乳腺癌臨床病理參數的關系

CD3+是所有成熟T細胞上存在的一種糖蛋白受體，表達于成熟T細胞表面，在組織內代表總的T淋巴細胞[7]。T淋巴細胞是炎癥反應的重要細胞，也是腫瘤免疫的主要效應細胞，能識別并殺傷腫瘤細胞。研究發現，在乳腺癌組織內T淋巴細胞在癌間質和癌巢內大量分布，提示腫瘤細胞正式啟動了細胞免疫應答機制，這也預示著隨著T淋巴細胞的數量在腫瘤周圍大量聚集，阻礙腫瘤細胞的增殖，延緩了腫瘤的進展[8]。CD68+是一種主要表達于單核-巨噬細胞系統的胞漿蛋白，表達于巨噬細胞表面，在組織內代表總的TAM[9]。近年來，多項研究表明，TAM在腫瘤微環境中有促進腫瘤血管生成和細胞增殖的作用，從而促進腫瘤的進展[10-11]。根據巨噬細胞的活化類型及其在腫瘤微環境中的不同作用，主要將其分為兩種極化類型，即經典活化的M1型和替代性活化的M2型。M1型主要誘導Th1型免疫應答，釋放大量細胞因子，如ROS、NO等，產生細胞毒作用殺傷腫瘤；M2型主要誘導Th2型免疫應答，特征性表達CD163、CD206，抑制炎癥促進腫瘤生長[12-13]。在Mohammed等[14]研究中，乳腺癌癌間質中T淋巴細胞與TAM大量浸潤，分別扮演著阻礙和促進腫瘤細胞的進展作用。本研究結果顯示，乳腺癌浸潤T淋巴細胞越少，Ki-67增值指數越高；乳腺癌浸潤CD68+TAM越多，Ki-67增值指數也越高。Ki-67是判斷腫瘤細胞處于增殖期的生物標志，能準確地反映腫瘤細胞的增殖活性[15]，表達于細胞核的非組蛋白，伴隨著腫瘤的增殖、侵襲及轉移等過程。本研究結果顯示，T淋巴細胞浸潤數量與乳腺癌腫塊大小、淋巴結轉移、ER和PR密切相關；CD68+TAM浸潤數量與乳腺癌患者年齡、淋巴結轉移和HER2有關。隨著乳腺腫塊的增大及淋巴結的受累等，T淋巴細胞浸潤數量明顯減少，而CD68+TAM浸潤明顯增加。

綜上所述，乳腺癌癌間質中浸潤的T淋巴細胞和CD68+TAM與乳腺癌患者Ki-67蛋白表達顯著相關。不僅如此，T淋巴細胞的數量分布還與腫塊大小、淋巴結轉移及ER、PR有關，CD68+TAM的浸潤數量與患者年齡、淋巴結轉移及HER2差異顯著。因此，乳腺癌浸潤的CD68+TAM與乳腺癌的進展密切相關，可用來預測乳腺癌的生物學行為以及乳腺癌免疫治療的潛在干預靶點，并進一步深入研究相關分子機制。