不同種植模式下丹參根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

王 悅,楊貝貝,王 浩,楊 程,張 菊,朱 濛,楊如意

1 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241002 2 安徽省水土污染治理與修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241002

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬的一種多年生草本植物,以干燥的根和根狀莖入藥(Danshen)。丹參是一味常用的傳統(tǒng)中藥材,對(duì)冠心病、心膠痛、心肌梗死和高血壓等心血管系統(tǒng)疾病具有顯著療效[1],其植株浸提液還具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤和抗炎癥等功能[2- 5]。丹參屬大宗中藥材,市場(chǎng)需求量大,但野生資源稀缺,適宜人工栽培的道地產(chǎn)區(qū)也非常有限,導(dǎo)致其栽培地重茬連作現(xiàn)象十分普遍。長(zhǎng)期連作造成丹參枯萎病、根腐病、根結(jié)線蟲(chóng)病加劇,生長(zhǎng)勢(shì)減弱,黃苗、死苗、裂根等現(xiàn)象嚴(yán)重,有效成分含量和商品率逐年下降,產(chǎn)生連作障礙(continuous cropping obstacles)[6]。連作障礙在人參(PanaxginsengC. A. Meyer)、地黃(Rehmanniaglutinosa(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.)、三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)等其他中藥材栽培過(guò)程中也普遍存在,且影響非常嚴(yán)重。因此,研究連作障礙的發(fā)生機(jī)理對(duì)于提出合理有效的消減措施,保障中藥材生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和藥材資源供應(yīng)的安全性具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

丹參連作障礙的發(fā)生機(jī)理十分復(fù)雜,包括化感自毒作用、根際理化環(huán)境失衡,以及微生物區(qū)系的變化[7- 8]等。近年來(lái),從植物-土壤-微生物組成的根際微生態(tài)系統(tǒng)探討連作障礙的成因和消減措施已成為一個(gè)新的研究思路和重要的發(fā)展趨勢(shì)[9- 11]。丹參根際次生代謝物的產(chǎn)生與釋放,以及在環(huán)境介質(zhì)中的遷移、轉(zhuǎn)化、降解等過(guò)程與根際微生物之間存在密切的相互作用。研究發(fā)現(xiàn),蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)和內(nèi)生菌等不僅能夠促進(jìn)丹參根系的生長(zhǎng),而且會(huì)誘導(dǎo)其產(chǎn)生更多丹參酮和丹酚酸B[12- 14]。但是,連作條件下大量次生代謝物的積累將改變土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu),使根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡,從而對(duì)植物產(chǎn)生負(fù)反饋[15]。已有研究證實(shí),丹參酮和丹酚酸B等均具有很強(qiáng)的抑菌作用[2,16],會(huì)導(dǎo)致根際放線菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[8],有益微生物數(shù)量減少,致病菌增加,使丹參更易受病原菌侵染,抗逆性降低[9, 17]。在農(nóng)林生產(chǎn)實(shí)踐中,輪作、間作、套作可以有效緩解連作障礙,這與植物根系之間的地下化學(xué)作用有關(guān)[18],但相關(guān)的微生態(tài)機(jī)理尚不清楚。

安徽省亳州市是國(guó)家科技部批準(zhǔn)建立的中藥特色產(chǎn)業(yè)基地,具有多年從事丹參栽培和加工的歷史。本課題組于2016年6月調(diào)研發(fā)現(xiàn),連作兩年以上丹參即出現(xiàn)黃苗和枯萎現(xiàn)象(枯苗率10%—20%),產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降,與玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)、桔梗(Platycodonisradix)等其他根類藥材實(shí)行輪作方可緩解(枯苗率<5%)。本研究通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Ρ确治隽溯喿鳌⑦B作、套作3種栽種模式下丹參根際微生物群落的變化,嘗試從微生態(tài)系統(tǒng)的變化闡明丹參連作障礙的發(fā)生機(jī)理,為緩解這一重大生產(chǎn)難題,加快建立道地中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范化(Good Agricultural Practice, GAP)基地提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況和樣品采集

本研究采樣點(diǎn)位于安徽省亳州市譙城區(qū)十八里鎮(zhèn)的一處中藥材種植基地(33°52′48″N, 115°46′12″E)。該地位于皖豫交界處,地勢(shì)平坦,屬于暖溫半濕潤(rùn)季風(fēng)性氣候,雨熱同季,年均降水量約821.3 mm,年均氣溫約14.9℃,年均日照約2184 h。土壤質(zhì)地屬沙質(zhì)或沙淤兩合土質(zhì),種植有丹參、白芍(PaeonialactifloraPall.)、桑(MorusalbaL.)、桔梗、亳菊(Chrysanthemummorifoliumcv. Boju)等中藥材,種植歷史悠久。

本研究采集的丹參包括3種種植模式：即與桔梗輪作1年(rotation cropping monoculture, RCMO),連作2年(continuous cropping monoculture, CCMO)和與白芍連續(xù)套作2年(intercropping mix-culture, ICMI)。輪作或連作丹參的密度約為112500—120000株/hm2,套作丹參的密度約為60000株/hm2,白芍密度約為45000株/hm2。白芍種植時(shí)間為10月,次年3—4月套作丹參。

每種種植模式隨機(jī)選取3個(gè)面積為2 m×2 m的樣方,將樣方內(nèi)的丹參整株取出,采用抖根法收集根際土壤,同一樣方內(nèi)的土樣混合均勻作為一個(gè)混合樣,所有土壤樣品立即帶回實(shí)驗(yàn)室,4℃冰箱保存。混勻的土樣一部分風(fēng)干保存,測(cè)定土壤理化性質(zhì),另一部分新鮮土壤用于提取微生物總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定

稱取過(guò)1 mm篩孔的風(fēng)干土10 g,加入1 mol/L的KCl溶液25 mL(土水比為1∶2.5),搖勻30 min后用pH計(jì)測(cè)定土壤pH。土壤氧化還原電位(oxidation reduction potential, ORP)采用鉑電極法測(cè)定。土壤有機(jī)質(zhì)采用K2Cr2O7-H2SO4稀釋熱法測(cè)定[19]。土壤全磷和速效磷濃度分別采用H2SO4-HClO4消解和HCl-H2SO4浸提,鉬銨藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定[19]。同時(shí),稱量100 g新鮮土壤在105℃烘箱干燥8小時(shí)計(jì)算土壤含水率。

1.2.2細(xì)菌宏基因組16S rDNA測(cè)序

利用土壤基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit, OMEGA)提取細(xì)菌總DNA。總DNA用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性,然后用于 PCR擴(kuò)增。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量,以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3—V4通用引物(341F/805R)。

PCR體系包括2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL、primer R (10 μmol/L) 1 μL、Genomic DNA 10—20 ng,補(bǔ)充無(wú)菌水至30 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,45℃退火20 s、65℃延伸30 s,共5個(gè)循環(huán);94℃變性20 s,55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共20個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后,引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR體系包括2×Taq master Mix 15 μL、primer F (10 μmol/L) 1 μL、primer R (10 μmol/L) 1 μL、Genomic DNA 20 ng,補(bǔ)充無(wú)菌水至30 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸30 s,共5個(gè)循環(huán);最后72度延伸5 min。PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,并對(duì)DNA進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒定量,根據(jù)測(cè)得的DNA濃度,將所有樣品按照1∶1的比例進(jìn)行混合,混合后充分震蕩均勻。等量混合時(shí),每個(gè)樣品DNA量取10 ng,最終測(cè)序濃度為20 pmol。該混合樣品由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行后續(xù)的樣品建庫(kù)與宏基因測(cè)序。

1.2.3真菌宏基因組18S rDNA測(cè)序

真菌總DNA提取、檢測(cè)方法與細(xì)菌相同,18S V4區(qū)通用引物為V43NDF/Euk_V4_R。

PCR體系包括10×PCR buffer 5 μL、dNTP (10 mmol/L each) 0.5 μL、Genomic DNA10 ng、Bar-PCR primer F(50 μmol/L) 0.5 μL、primer R (50 μmol/L) 0.5 μL、Plantium Taq (5 U/μL) 0.5 μL,補(bǔ)充無(wú)菌水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,45℃退火20 s、65℃延伸30 s,共5個(gè)循環(huán);94℃變性20 s,55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共20個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后,引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR體系包括10×PCR buffer 5 μL、dNTP (10 mmol/L each) 0.5 μL、DNA 20 ng、primer F (50 μmol/L) 0.5 μL、primer R (50 μmol/L) 0.5 μL、Plantium Taq (5 U/μL) 0.5 μL,補(bǔ)充無(wú)菌水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸30 s,共5個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)檢測(cè)、回收、混合、建庫(kù)、測(cè)序等處理與細(xì)菌的方法相同。

1.2.4叢枝菌根真菌侵染率測(cè)定

將新鮮丹參的須根剪下,用自來(lái)水將根部土壤沖洗干凈,然后放置在FAA固定液(甲醛∶醋酸∶50%酒精=5∶ 5∶90)中固定,洗凈固定液,加入10%的KOH溶液,90℃下水浴加熱10 min,之后在10%的鹽酸中酸化15 min,最后用酸性品紅染色過(guò)夜。將須根剪成約2 cm的小段,用十字交叉法計(jì)算侵染率[20]。

1.3 分析方法

1.3.1數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0對(duì)土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(SPSS, Inc., Chicago, IL),先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)(Normal distribution and homogeneity of variance test),然后做單因素方差分析(One way ANOVA)。不同處理的均值在5%的顯著性水平下做LSD(Least significant difference)多重比較。

1.3.2微生物多樣性、網(wǎng)絡(luò)及相互作用分析

將多條序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類,根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU),序列相似性域值設(shè)為0.97。采用uclust軟件(v1.1.579)對(duì)OTU進(jìn)行聚類,uclust首先篩選出序列中最長(zhǎng)的reads作為種子序列,找出所有與該序列的相似度在閾值范圍內(nèi)的序列,并歸為一個(gè)類,而后依次執(zhí)行此步驟,直到所有序列均完成聚類,每一個(gè)類作為一個(gè)OTU。

微生物Alpha多樣性指標(biāo)包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)、豐富度指數(shù)(richness)、均勻度和覆蓋度,各指數(shù)的計(jì)算方法參見(jiàn)邵宗圓等人的方法[21]。

細(xì)菌群落Beta多樣性可以用來(lái)比較多組樣本之間的差別,本研究利用Fast UniFrac軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA)。

選取豐富度高于1%或豐富度排序在前100位的物種,利用QIIME(v1.8.0)和SparCC軟件(v1.0.0)分別進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)(network)分析和微生物之間相互作用關(guān)系分析。

1.3.3基于Canoco軟件的冗余分析(RDA)

利用Canoco(v 4.5, Centre for Biometry, Wageningen, The Netherlands)軟件分析土壤理化因子和細(xì)菌群落之間的關(guān)系。首先,對(duì)丹參根際土壤細(xì)菌群落做降趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)。結(jié)果顯示,細(xì)菌的第一排序軸長(zhǎng)度為0.594,真菌的第一排序軸長(zhǎng)度為0.783,均小于3,因此本研究選擇基于線性模型的冗余分析(Reundancy analysis, RDA)進(jìn)行排序[22]。

蒙特卡羅置換檢驗(yàn)(Monte Carlo permutation)用以檢驗(yàn)限制性排序模型的顯著性,置換次數(shù)選擇默認(rèn)值499次。預(yù)篩選(Forward selections)可以檢驗(yàn)?zāi)姆N環(huán)境因子對(duì)微生物群落組成有顯著性的影響。根據(jù)預(yù)篩選的結(jié)果,通過(guò)偏冗余分析(partial RDA)的variation partitioning能夠確定具有顯著性影響的各因子的貢獻(xiàn)率[22]。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示,所有土壤均屬于酸性土,不同樣點(diǎn)的酸度有顯著差異(P<0.05),其中連作兩年的土壤pH最低,而輪作土壤pH最高。土壤呈氧化狀態(tài),輪作和連作土壤的ORP無(wú)顯著差異,但套作土壤的ORP明顯低于其他兩種種植模式。土壤有機(jī)質(zhì)在12.92—21.51 g/kg之間,含量較高,且呈現(xiàn)輪作<連作<套作的規(guī)律。連作兩年的丹參根際土壤總磷和總鉀均最低,但有效磷和有效鉀的變化趨勢(shì)與總磷和總鉀有所不同。3種種植模式下,丹參根際土壤微生物量(以DNA含量計(jì))沒(méi)有明顯差異,但呈現(xiàn)連作<套作<輪作的趨勢(shì)。

表1 土壤理化性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 不同字母標(biāo)記的數(shù)值表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異; RCMO: 輪作, Rotation cropping monoculture; CCMO: 連作, Continuous cropping monoculture; ICMI: 套作, Intercropping mix-culture

2.2 丹參根部AMF真菌的侵染率

本研究未單獨(dú)分析丹參根際AMF的群落變化,僅測(cè)定了其侵染率。從表2可以看出,3種種植模式下丹參根部AMF真菌的侵染率有明顯差異(P<0.05),其中連作兩年的丹參根部AMF侵染率最低,僅為23.57%,而輪作丹參的侵染率最高,達(dá)44.67%。

表2 3種種植模式下叢枝菌根真菌對(duì)丹參的侵染率/%

2.3 丹參根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1細(xì)菌群落Alpha多樣性

3種種植模式下測(cè)序文庫(kù)的覆蓋度均達(dá)到97%以上,說(shuō)明絕大部分細(xì)菌的序列可以被測(cè)出,測(cè)序結(jié)果有較好的代表性。細(xì)菌豐富度指數(shù)通過(guò)OTU的個(gè)數(shù)來(lái)計(jì)算,可以衡量細(xì)菌的物種數(shù),數(shù)量均在5000條以上,表明細(xì)菌豐富度非常高。輪作條件下,丹參根際細(xì)菌群落的香農(nóng)-威納指數(shù)顯著高于連作和套作(P<0.05,表3),其他Alpha多樣性指數(shù)在3種種植模式之間均無(wú)顯著差異,但均呈現(xiàn)輪作>套作>連作的變化趨勢(shì)。雖然都是種植兩年,但套作丹參根際的細(xì)菌多樣性明顯好于連作。

表3 土壤細(xì)菌Alpha多樣性指標(biāo)

2.3.2細(xì)菌主要類群及分布

3種種植模式下,相對(duì)豐富度排名前10的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌所占比例均達(dá)到94%以上,盡管排序有所差異,但前10個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)在3種種植模式中是相同的(圖1),包括Proteobacteria(變形菌門(mén))、Acidobacteria(酸桿菌門(mén))、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門(mén))、Planctomycetes(浮霉菌門(mén))、Actinobacteria(放線菌門(mén))、Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))、Verrucomicrobia(疣微菌門(mén))、Unclassified(未分類門(mén))、Firmicutes(厚壁菌門(mén))和Chloroflexi(綠彎菌門(mén))。芽單胞菌門(mén)在輪作模式下占比僅為5.01%,與連作和套作相比明顯下降(P<0.05)。其他細(xì)菌門(mén)在3種種植模式之間無(wú)明顯差異,但是浮霉菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在連作模式下的相對(duì)豐富度均低于其他兩種模式。

圖1 3種種植模式下主要細(xì)菌類群相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of the major bacterial phylogenetic groups under three cropping modesRCMO: 輪作, Rotation cropping monoculture; CCMO: 連作, Continuous cropping monoculture; ICMI: 套作, Intercropping mix-culture

2.3.3細(xì)菌群落PCoA分析

由圖2可見(jiàn),3種種植模式中3 個(gè)重復(fù)并不聚類于同一象限,表明組內(nèi)變異較大,3種種植模式之間細(xì)菌群落沒(méi)有發(fā)生明顯的分化。PCoA分析結(jié)果表明,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變異受 8 個(gè)主坐標(biāo)成分的控制(累積解釋的總方差達(dá)100%),主坐標(biāo)成分的特征值均大于0.769,其中前兩個(gè)主坐標(biāo)成分影響最大,分別能夠解釋 15.08%和 13.97%的變異,累積解釋能力達(dá) 29.05%。但是,所有主坐標(biāo)成分的特征值相差不大,說(shuō)明本研究中影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子并不明顯。

圖2 3種種植模式下細(xì)菌群落PCoA聚類分析 Fig.2 Principal coordinates analysis (PCoA) of bacterial communities under three cropping modes

2.4 丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.4.1真菌群落 Alpha多樣性

真菌群落的豐富度均在600條以上,數(shù)量顯著低于細(xì)菌。由于數(shù)量相對(duì)較少,3種種植模式下測(cè)序文庫(kù)的覆蓋度均達(dá)到100%,表明測(cè)序結(jié)果有較好的代表性。真菌群落的所有Alpha多樣性指數(shù)在3種種植模式之間均無(wú)明顯差異(P>0.05,表4),但是除了覆蓋度和辛普生指數(shù)以外,均呈現(xiàn)輪作>套作>連作的變化趨勢(shì)。

表4 土壤真菌Alpha多樣性指標(biāo)

2.4.2真菌的主要類群及分布

共發(fā)現(xiàn)9個(gè)真菌門(mén),其中未分類門(mén)相對(duì)豐富度最高,除此之外其他所有真菌門(mén)的相對(duì)豐富度在31.96%—51.48%,說(shuō)明土壤中已知真菌類群較少,尤其是連作模式(圖3)。已知真菌主要包括Ascomycota(子囊菌門(mén))、Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén))、Zygomycota(接合菌門(mén))、Chytridiomycota(壺菌門(mén))、Neocallimastigomycota(新麗鞭毛菌門(mén))、Glomeromycota(球囊菌門(mén))、Fungi_Incertae_Sedis(未知菌門(mén))和Blastocladiomycota(芽枝霉菌門(mén))等。除未分類門(mén)以外,子囊菌門(mén)在所有種植模式中的相對(duì)豐富度最高,但是套作(15.22%)顯著高于連作(9.31%)。同樣,輪作模式下接合菌門(mén)和壺菌門(mén)的相對(duì)豐富度也顯著高于連作模式(P<0.05)。

圖3 3種種植模式下主要真菌類群相對(duì)豐富度Fig.3 Relative abundance of the major fungi phylogenetic groups under three cropping modes

2.4.3真菌群落PCoA分析

與細(xì)菌群落類似,3種種植模式中真菌群落的3個(gè)重復(fù)也較分散,種植模式之間沒(méi)有明顯分化。PCoA分析結(jié)果表明,真菌群落組成的變異受8個(gè)主坐標(biāo)成分的控制,主坐標(biāo)成分的特征值均大于0.890,其中前兩個(gè)主坐標(biāo)成分影響最大,分別能夠解釋14.12%和13.63%的變異,累積解釋能力達(dá)27.75%(圖4)。但是,所有主坐標(biāo)成分的特征值相差不大,說(shuō)明本研究中影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子并不明顯。

圖4 3種種植模式下真菌群落PCoA聚類分析 Fig.4 Principal coordinates analysis (PCoA) of fungi communities under three cropping modes

2.5 土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)分析和相互作用關(guān)系

網(wǎng)絡(luò)分析表明,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)在3種種植模式之間變化不大,只有芽單胞菌門(mén)在輪作模式下的豐富度顯著低于連作和套作(P<0.05);而非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)的變化較大,尤其是熱脫硫桿菌門(mén)(Thermodesulfobacteria),但其變化趨勢(shì)與芽單胞菌門(mén)剛好相反(P<0.01)。連作模式下Ignavibacteriae門(mén)和Deinococcus-Thermus門(mén)之間存在顯著的負(fù)相互作用(P<0.05),而套作和輪作模式下只有正相互作用,如變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)(套作,P<0.05),衣原體門(mén)(Chlamydiae)和藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria/Chloroplast)(輪作,P<0.01)。但是,未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌門(mén)之間的相互作用關(guān)系在不同種植模式下發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變的情況。

套作模式下球囊菌門(mén)和子囊菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)度較高,而輪作模式下新麗鞭毛菌門(mén)、壺菌門(mén)和接合菌門(mén)占優(yōu)勢(shì),但連作模式下未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)。雖然真菌門(mén)數(shù)量很少,它們之間的相互作用卻更加復(fù)雜。連作模式下球囊菌門(mén)與子囊菌門(mén)、未知菌門(mén)均有負(fù)相互作用,但在輪作模式下球囊菌門(mén)與子囊菌門(mén)之間轉(zhuǎn)變?yōu)檎嗷プ饔?P<0.01);套作模式下未知菌門(mén)與接合菌門(mén)、新麗鞭毛菌門(mén)有負(fù)相互作用,但在輪作模式下均轉(zhuǎn)變?yōu)檎嗷プ饔?P<0.01)。

2.6 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

蒙特卡羅置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示,第一典范軸P值為0.087(F=0.487),所有典范軸的P值為0.027(F=1.458),表明該排序模型的解釋變量(即土壤環(huán)境因子)可以很好地解釋響應(yīng)變量(即土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu))的變化,但第一典范軸的影響不顯著。丹參根際土壤細(xì)菌群落與根際土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見(jiàn)表5,其中RDA前兩個(gè)排序軸的特征值分別為0.328和0.133,分別解釋了32.8%和13.3%的細(xì)菌群落變化。本文所選的8個(gè)土壤環(huán)境因子共解釋了86.2%的總特征值,說(shuō)明對(duì)丹參根際土壤細(xì)菌群落有顯著影響。

表5 土壤細(xì)菌群落冗余分析

圖5 3種種植模式下細(xì)菌群落和土壤理化因子間的RDA雙序圖Fig.5 The RDA biplots generated from bacterial communities under three cropping modes and soil physicochemical properties圖中黑線和實(shí)心箭頭表示顯著性因子, 黑線和空心箭頭表示非顯著性因子;OM: 有機(jī)質(zhì), Organic matter; TP: 總磷, Total phosphorus; AP: 有效磷, Available phosphorus; TN: 總氮, Total nitrogen; TK: 總鉀, Total potassium; AK: 有效鉀, Available potassium; ORP: 氧化還原電位, Oxidation reduction potential

為了研究影響丹參根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素,對(duì)8個(gè)土壤理化因子進(jìn)行預(yù)篩選。結(jié)果表明,只有土壤總鉀(TK,P=0.034,F=2.24)對(duì)細(xì)菌群落的構(gòu)建有顯著性影響(P<0.05)。RDA雙序圖(圖5)顯示,TK對(duì)套作模式下丹參根際細(xì)菌群落有正向影響,相反對(duì)連作模式下的細(xì)菌群落不利。

2.7 土壤真菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

蒙特卡羅置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示,第一典范軸P值為0.332(F=0.961),所有典范軸的P值為0.604(F=0.979),表明該排序模型的解釋變量(即土壤環(huán)境因子)與響應(yīng)變量(即土壤真菌群落結(jié)構(gòu))的變化關(guān)系不大。丹參根際土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見(jiàn)表6,其中RDA前兩個(gè)排序軸的特征值分別為0.490和0.239,分別解釋了49.0%和23.9%的真菌物種變化。本文所選的8個(gè)土壤環(huán)境因子共解釋了87.3%的總特征值,對(duì)丹參根際土壤真菌群落有顯著影響。

偏冗余分析的結(jié)果表明,8個(gè)土壤因子中只有有效鉀(AK)和ORP對(duì)真菌群落的構(gòu)建有顯著性影響(表7,P<0.05),分別可以解釋19.7%和4.40%的真菌群落變化。從雙序圖中可以看出,影響真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵土壤因子在不同種植模式下有明顯差異,套作丹參根際真菌群落主要受AK影響,而輪作和連作主要受ORP影響(圖6)。

表7 土壤環(huán)境因子偏冗余分析(pRDAs)

圖6 3種種植模式下真菌群落和土壤理化因子間的RDA雙序圖Fig.6 The RDA biplots generated from fungi communities under three cropping modes and soil physicochemical properties

3 討論

根際土壤微生物對(duì)植物的生長(zhǎng)繁殖、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收運(yùn)輸和殘?bào)w分解等方面具有重要影響,它們與植物之間存在著十分緊密的相互作用,也是環(huán)境土壤學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。植物在連作后其根系分泌物、殘根和凋落物的質(zhì)與量會(huì)發(fā)生顯著變化,從而對(duì)根際土壤微生物產(chǎn)生明顯的影響[23-24]。

3.1 不同種植模式下丹參根際微生物群落的變化

本研究利用高通量測(cè)序法對(duì)丹參根際土壤中的微生物群落進(jìn)行了測(cè)序和分析。從種植時(shí)間上來(lái)看,細(xì)菌的豐富度、香農(nóng)-威納指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)隨丹參種植年限增加而降低,其中香農(nóng)-威納指數(shù)顯著降低。但是,真菌的Alpha多樣性指數(shù)均無(wú)顯著變化,變化規(guī)律與細(xì)菌相似。真菌Simpson指數(shù)雖然隨種植年限增加呈上升趨勢(shì),但變異主要來(lái)自組內(nèi)。從種植模式而言,套作在一定程度上能夠提高土壤微生物群落多樣性,因?yàn)榇蠖鄶?shù)Alpha多樣性指標(biāo)都高于連作。由于亳州地區(qū)丹參連作障礙非常嚴(yán)重,因此很少連作兩年以上,這可能是多數(shù)微生物群落多樣性指標(biāo)沒(méi)有發(fā)生顯著變化的原因之一。相比而言,新疆的棉花連作時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)30年,根際細(xì)菌群落多樣性的變化要明顯的多[23]。除連作時(shí)間的影響以外,土壤性質(zhì)和丹參品種也可能導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性的變化有所差異。Tang等發(fā)現(xiàn),四川中江縣的丹參連作1—3年,其根際真菌群落的豐富度和香農(nóng)-威納指數(shù)與未耕作地相比均顯著降低[8]。

從根際微生物聚類分析的結(jié)果來(lái)看,無(wú)論細(xì)菌還是真菌群落在3種種植模式之間均沒(méi)有發(fā)生顯著分化。但是,出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與各種種植模式組內(nèi)差異較大有關(guān),微生物群落組成的細(xì)微差別,以及由此造成的根際微生物與丹參相互作用關(guān)系的變化仍然值得關(guān)注。由于微生物,尤其是細(xì)菌的種類較多,本研究從門(mén)這一較高的分類單元進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析。芽單胞菌門(mén)在輪作模式下的相對(duì)豐富度顯著低于連作和套作,表明該門(mén)的細(xì)菌對(duì)連作環(huán)境的耐受性較強(qiáng),有可能成為連作模式下的優(yōu)勢(shì)菌。與此相反,輪作和套作時(shí)浮霉菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐富度則高于連作,說(shuō)明這兩個(gè)門(mén)的細(xì)菌對(duì)連作環(huán)境較為敏感,保持根際微環(huán)境的多樣性對(duì)它們有利。真菌的數(shù)量遠(yuǎn)小于細(xì)菌,套作模式下占優(yōu)勢(shì)的子囊菌門(mén)的相對(duì)豐富度顯著高于連作。與此類似,輪作模式下接合菌門(mén)和壺菌門(mén)的相對(duì)豐富度也顯著高于連作模式。

AMF是一種普遍存在的專性內(nèi)共生真菌,可以通過(guò)侵染植物根系和植物形成共生體系。AMF需要依靠宿主獲得C源,同時(shí)能夠增強(qiáng)植物獲取P等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的能力,從而實(shí)現(xiàn)互利共生。被AMF真菌侵染可以提高植物的抗逆性、抗病蟲(chóng)害等能力,促進(jìn)植物的生長(zhǎng),提高作物的質(zhì)量和產(chǎn)量[25]。研究發(fā)現(xiàn),AMF不僅可以改善連作丹參的生長(zhǎng),而且能夠增加丹酚酸B、丹參酮的產(chǎn)量和對(duì)鐵、錳等微量元素的積累[13, 26]。本研究表明,隨著種植年限的增加,無(wú)論是連作還是套作,AMF真菌對(duì)丹參根部的侵染率均顯著下降。另外,與套作相比,連作丹參的AMF真菌侵染率降低,但未達(dá)到顯著水平。

3.2 丹參根際微生物群落變化的原因及與連作障礙的關(guān)系

大量研究結(jié)果表明,陸地生態(tài)系統(tǒng)中地上的植物多樣性,以及土地利用方式或耕作方式的變化是驅(qū)動(dòng)地下微生物群落多樣性、代謝類型多樣性變化的重要因素[18, 23, 27-28]。丹參連作會(huì)導(dǎo)致土壤酸化,團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)破壞,土壤營(yíng)養(yǎng)失衡等現(xiàn)象[6]。本研究結(jié)果表明,輪作和套作不僅提高了土壤pH,降低了ORP,改善了部分土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng),而且能夠在一定程度上影響丹參根際的微生物群落組成,從而可能對(duì)緩解連作障礙起到積極作用。微生物群落結(jié)構(gòu)受8個(gè)主坐標(biāo)成分的影響,但前兩個(gè)主坐標(biāo)成分的綜合解釋能力均小于30%,表明沒(méi)有顯著的主導(dǎo)因子。本研究將8個(gè)土壤環(huán)境因子通過(guò)冗余分析投影成4個(gè)典范軸。結(jié)果表明,土壤性質(zhì)的變化對(duì)細(xì)菌群落的影響較大,但對(duì)真菌群落的影響不明顯。因此,真菌群落變化的主導(dǎo)因素并非土壤理化性質(zhì)。研究表明,植物根際分泌物可以直接或間接影響微生物群落[8, 23- 24],但由于丹參根際分泌物組成復(fù)雜本研究未將此因子納入冗余分析。總鉀和有效鉀可以提高套作模式下細(xì)菌和真菌群落的多樣性,說(shuō)明丹參和白芍套作形成的根際微環(huán)境更適合喜鉀微生物的生長(zhǎng)。而輪作和連作模式下的真菌群落與此剛好相反,它們更適應(yīng)低鉀和高ORP的環(huán)境。

研究表明,在低P環(huán)境下AMF對(duì)宿主的侵染率較高[29- 30]。但本研究發(fā)現(xiàn),連作條件下丹參根際土壤的總磷和有效磷均低于輪作。因此,土壤營(yíng)養(yǎng)條件的變化可能不是導(dǎo)致AMF侵染率下降的主要原因。由于丹參是根類藥材,根際分泌物將隨著種植時(shí)間的增加在土壤中發(fā)生積累,并引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化[8, 23- 24],這可能是導(dǎo)致AMF侵染率下降的潛在原因之一,但具體機(jī)制還要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。AMF侵染率的下降可能會(huì)造成連作丹參的品質(zhì)和產(chǎn)量降低[13, 26],抗病能力下降,進(jìn)一步加劇連作障礙。鐮刀菌屬(Fusariumgenus)是丹參枯萎病和根腐病的主要病原菌。雖然該屬在真菌中的相對(duì)豐富度很低(0.01%),但間作和套作兩種模式下均未發(fā)現(xiàn)該菌,僅在連作模式下有檢出。另外,有研究發(fā)現(xiàn)枯草桿菌屬(Bacillusgenus)和AMF可以有效控制枯萎病的發(fā)生[31-32],屬有益菌。但本研究發(fā)現(xiàn),連作模式下枯草桿菌屬的相對(duì)豐富度(0.18%)低于套作(0.22%)和輪作(0.26%),AMF的侵染率也同樣顯著下降。微生物組成和功能群的變化會(huì)影響根際有機(jī)質(zhì)的代謝和循環(huán),改變根際微環(huán)境,以及微生物與植物之間的關(guān)系,這也可能是導(dǎo)致連作障礙的重要原因之一[33]。此外,本研究表明,不同的丹參種植模式下微生物之間的相互關(guān)系有明顯差異。細(xì)菌在輪作和套作模式下均表現(xiàn)為正相互作用,但在連作模式下存在負(fù)相互作用,而輪作甚至還會(huì)造成真菌之間的相互關(guān)系發(fā)生逆轉(zhuǎn)。這種現(xiàn)象與丹參連作障礙是否有關(guān)值得進(jìn)一步深入研究

本研究的結(jié)果僅基于一次性取樣,只能表征一個(gè)時(shí)間斷面上的變化。未來(lái)應(yīng)開(kāi)展不同種植模式下丹參根際微生態(tài)環(huán)境的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),這對(duì)于揭示連作障礙發(fā)生機(jī)理和探索應(yīng)對(duì)策略具有重要意義。