犬DEA1.1 血型抗體間接Dot-ELISA 檢測方法建立

王 娟，姜忠玲，豐艷妮，叢 霞，曹榮峰，田文儒，李華濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島266109)

在犬臨床輸血治療過程中,DEA1.1 和DEA1.2的抗原-抗體反應(yīng)是導(dǎo)致急性輸血性溶血的最主要因素[1],鑒定DEA1.1 血型是非常必要的。目前,在獸醫(yī)臨床上缺乏準(zhǔn)確、簡便和便宜的犬血型鑒定試劑。由于犬的血型系統(tǒng)復(fù)雜[2-10],品種繁多[11-15],又缺乏強(qiáng)大的抗體制備和篩選技術(shù)。至今國際上存在的僅有Andrews 等在1992 年研制出了DEA1.1 血型定型單克隆抗體[16]。Hara 等1991 年研制出DEA3血型定型單克隆抗體,由于實(shí)驗(yàn)室管理不善消失[17]。現(xiàn)如今,對犬血型可以用多克隆免疫抗體鑒定。但是所制備的多克隆免疫抗體必須用已知血型的試劑紅細(xì)胞篩查方可應(yīng)用于臨床。由于試劑紅細(xì)胞常規(guī)保存方法較短,而不同血型的紅細(xì)胞又很難收集并應(yīng)用到免疫血清和單克隆抗體的篩選中。所以,本研究欲建立一個更為簡單和敏感的方法,以作為不使用試劑紅細(xì)胞檢測犬DEA1.1 血型抗體的替代方法。

1 材料

1.1 樣品來源 血液樣本采自廣東及周邊地區(qū)養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的158 只實(shí)驗(yàn)用比格犬,使用EDTA 抗凝。

1.2 試劑及儀器設(shè)備 DEA1.1 陽性抗原紅細(xì)胞:經(jīng)QuickVet/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test 鑒定后紅細(xì)胞。DEA1.1 多克隆抗血清,購自加利佛尼亞國際動物血液資源庫。抗犬IgG 抗體,購自北京奧博森生物技術(shù)有限公司；凝聚胺介質(zhì)試劑盒,購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；HRP 酶標(biāo)抗犬IgG 二抗,購自BD 公司。TMB 儲存液:稱取20 mgTMB(固體),加10 mL 無水乙醇,在37 ℃振蕩,使其充分溶解,-20 ℃保存?zhèn)溆谩５孜锶芤?TMBH2O2):取0.5 mL TMB 儲存液于10 mL 底物緩沖液,再加1 μL 30%H2O2,混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 方法

2.1 樣本DEA1.1 血型鑒定 采用凝聚胺介質(zhì)試劑抗球蛋白實(shí)驗(yàn)檢測血型,將試管標(biāo)號并分別加入犬抗DEA1.1 多克隆抗體100 μL 和5%DEA1.1 陽性紅細(xì)胞各1 滴。各加LIM 0.7 mL,混合均勻后,再各加Polybrene 溶液2 滴,并混合均勻。用BASO專用離心機(jī)1 000 r/min 離心10 s,倒掉上清液,讓管底殘留約0.1 mL 液體。輕輕搖動試管,目測紅細(xì)胞有無凝集,如無凝集,須重新制作。最后加入Resuspending 2 滴,輕輕轉(zhuǎn)動試管混合并同時觀察結(jié)果。如果凝集散開,表示是由Polybrene 引起的非特異性聚集,DEA1.1 血型抗體篩檢結(jié)果為陰性；如凝集不散開,則為紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng),DEA1.1 血型抗體篩檢結(jié)果為陽性。

2.2 紅細(xì)胞膜的制備 將158 只犬采集的含有DEA1.1 抗原陰性和陽性的血液,按1∶10(v/v)的比例混于153.8 mmol/L NaCl 溶液(含抗凝劑EDTA 40.3 mmol/L)中。參照文獻(xiàn)描述的方法分離紅細(xì)胞膜[18],于-20 ℃下儲存直至使用。

2.3 Dot-ELISA 方法的建立 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)是一種實(shí)驗(yàn)室常用的簡單、重現(xiàn)性高的免疫診斷方法[19]。在本研究中,我們對該方法進(jìn)行了改進(jìn),通過自制的環(huán)形固定器將硝酸纖維素膜(NCM)固定到96 孔板的孔底(圖1)。使用0.01 mol/L pH 值為7.4 的PBS 稀釋紅細(xì)胞膜,于96 孔板中每個NCM點(diǎn)樣2 μL,使斑點(diǎn)直徑為2 mm,并在37 ℃下干燥10 min。 用5%w/v 的脫脂奶粉封閉緩沖液,在37 ℃下靜置孵育20 min,阻斷NCM 上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。0.01 mol/L PBS(pH 值為7.4)洗滌4次。使用封閉緩沖液1∶200 稀釋抗DEA1.1 多克隆抗體,加入到該板的孔中,并于37 ℃抗孵育30 min。按上述方法洗滌4 次。孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗,然后將該板于37 ℃孵育30 min。按照TMB 試劑盒說明書加入顯色液,在37 ℃下避光反應(yīng)5 ～15 min,停止反應(yīng),用蒸餾水沖洗96 孔板。用相機(jī)記錄試驗(yàn)結(jié)果。

圖1 固定硝酸纖維素膜到96 孔板孔中的模式圖

2.4 紅細(xì)胞膜中血紅蛋白殘留檢測 抗原包被濃度與所提取的紅細(xì)胞膜內(nèi)殘留的血紅蛋白含量有關(guān)。血紅蛋白可以和底物反應(yīng)顯色,抗原包被濃度較大可能會提高血紅蛋白殘留的含量,增加與血清中抗體進(jìn)行非特異性結(jié)合的幾率,進(jìn)而致使陰性血清出現(xiàn)斑點(diǎn)。所以在摸索過程中需設(shè)置不加血清只加底物顯色的試驗(yàn)組,排除血紅蛋白殘留的干擾。結(jié)果顯示的沒有出現(xiàn)斑點(diǎn)或顏色變化的稀釋度,是確定抗原包被濃度時所用到的最大濃度。用0.01 mol/L PBS(pH 值7.4)2 倍倍比稀釋提取的紅細(xì)胞膜,每孔NCM 上點(diǎn)樣2 μL,置于37 ℃烘箱中干燥10 min。將Dot-ELISA 96 孔板用3%脫脂乳于37 ℃培養(yǎng)箱中封閉30 min。向板內(nèi)加入0.01 mol/L PBS(pH值7.4)振搖洗滌3 次,每次5 min,棄去液體拍干。向孔中加入一定系適度底物顯色溶液,避光振搖顯色5 ～10 min。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。用相機(jī)記錄結(jié)果。

2.5 優(yōu)化細(xì)胞膜抗原濃度 將犬DEA1.1 陽性紅細(xì)胞膜2 倍倍比稀釋,2 μL 等份于NCM 上點(diǎn)樣,并在37 ℃下干燥10 min。封閉液1 ∶200 稀釋犬抗DEA1.1 多克隆抗血清和陰性血清。按照上述反應(yīng)程序進(jìn)行檢測,最終優(yōu)化獲得最佳抗原濃度。

2.6 Dot-ELISA 的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性檢測 采用相同的抗原濃度,倍比稀釋待檢血清,用Dot-ELISA 檢測,并與抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果相比確定其靈敏度。用陰陽性DEA1.1 犬紅細(xì)胞膜進(jìn)行點(diǎn)膜,用DEA1.1 陽性血清檢測,觀察有無交叉反應(yīng)以確定其特異性。整個體系不變的情況下,將提取的紅細(xì)胞膜反復(fù)凍融20 次進(jìn)行檢測,以及-20 ℃儲存11 個月后進(jìn)行檢測,測試間接Dot-ELISA 方法的穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣本驗(yàn)證間接Dot-ELISA 檢測方法 采用間接Dot-ELISA 方法,用犬DEA1.1 血型抗血清對收集的158 條犬的血液樣本進(jìn)行血型鑒定,結(jié)果與抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果做對比。

3 結(jié)果及分析

3.1 血液樣本DEA1.1 血型抗體檢測 加入Resuspending 后,輕輕搖動試管,可明顯發(fā)現(xiàn)陽性血液仍保持凝集狀態(tài),陰性血液凝集散開。顯微鏡下觀察,發(fā)生凝集的血液紅細(xì)胞呈團(tuán)塊狀存在,而未發(fā)生凝集的血液紅細(xì)胞呈單個存在。結(jié)果顯示,在158 只犬的血液樣本中,共計(jì)有12 只犬為DEA1.1陽性,146 只犬為陰性。

3.2 犬紅細(xì)胞膜DEA1.1 血型抗原鑒定及最佳作用濃度 提取的DEA1.1 血型陽性抗原(紅細(xì)胞膜),用間接Dot-ELISA 鑒定。提取的紅細(xì)胞膜可以保存犬血型DEA1.1 抗原,并用間接Dot-ELISA試驗(yàn)鑒定,可與DEA1.1 陽性血清反應(yīng),與空白血清不反應(yīng)(圖2)。抗原的濃度越大越容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合,即4 mg/mL 細(xì)胞膜處。陰性抗體血清顯示無色或沒有斑點(diǎn)出現(xiàn),陽性抗體血清顯示顏色最深的濃度為最佳的抗原包被濃度。提取的細(xì)胞膜在0.5 ～4 mg/mL 濃度,于硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣2 μL,不出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。細(xì)胞膜濃度在0.5 mg/mL 時能非常明確的鑒定出細(xì)胞膜上抗原(圖2)。

圖2 犬紅細(xì)胞膜DEA1.1 血型抗原鑒定

3.3 犬紅細(xì)胞膜血紅蛋白殘留的檢測 試驗(yàn)隨機(jī)挑選9 個樣本,由高到低共4 個濃度,點(diǎn)膜直接與TMB 顯色底物反應(yīng)。不同樣本由于提取細(xì)胞膜的過程中,血紅蛋白含量不一樣,因此顯色的顏色有差別,隨膜濃度的增高,顯示顏色也在加深,但是與抗體反應(yīng)后的陽性相比,差別非常明顯(圖3),說明我們提取的細(xì)胞膜血紅蛋白含量很低,完全能夠達(dá)到試驗(yàn)的要求。

圖3 犬紅細(xì)胞膜血紅蛋白殘留的檢測

3.4 特異性試驗(yàn) 用不同濃度的犬DEA1.1 陽性抗原和陰性抗原分別與陰性、陽性抗體抗血清反應(yīng),觀察間接Dot-ELISA 方法的特異性。結(jié)果顯示,具有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞膜,與陽性抗體抗血清反應(yīng),結(jié)果顯示深褐色斑點(diǎn)(+++),其他的無斑點(diǎn)(見中插彩版圖4),說明間接Dot-ELISA 檢測方法具有很高的特異性。

3.5 靈敏度試驗(yàn) 一定濃度的犬DEA1.1 陽性抗原與不同稀釋度(倍比稀釋)的陽性抗血清反應(yīng),并與凝聚介質(zhì)試驗(yàn)相比,觀察間接Dot-ELISA 方法的靈敏性。兩種方法相比,間接Dot-ELISA 方法比凝聚胺介質(zhì)試驗(yàn)靈敏度高8 倍(見中插彩版圖5)。說明間接Dot-ELISA 方法具有很高的靈敏度,能檢測出弱抗體或濃度較低的抗體。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 紅細(xì)胞膜在-20 ℃長時間保存,反復(fù)凍融20 次,固定于Dot-ELISA 板4 ℃保存后進(jìn)行檢測,觀察Dot-ELISA 方法的穩(wěn)定性。當(dāng)紅細(xì)胞膜在-20 ℃保存11 個月時并不影響檢測結(jié)果,反復(fù)凍融20 次也不影響檢測結(jié)果。固定在Dot-ELISA 板4 ℃保存后發(fā)現(xiàn)2 個月內(nèi)不影響檢測結(jié)果(圖6)。說明Dot-ELISA 具有很高的穩(wěn)定性,可長期保存抗原,替換掉試劑紅細(xì)胞。

3.7 臨床樣本檢測 提取158 只犬紅細(xì)胞膜用DEA1.1 抗血清進(jìn)行細(xì)胞抗原檢測。并與凝聚胺介質(zhì)試驗(yàn)相比,觀察兩種方法的符合率。用DEA1.1抗原陽性的細(xì)胞膜對158 分犬血清進(jìn)行DEA1.1 抗體檢測。臨床樣本檢測各個對比試驗(yàn)顯示,符合率均為100%。說明Dot-ELISA 檢測方法可以用于抗體的篩查。

圖6 間接Dot-ELISA 方法穩(wěn)定性檢測

4 討論

Dot-ELISA 的基本原理與常規(guī)ELISA 和免疫酶染色法基本相同,即將抗原或抗體首先吸附在纖維素薄膜(如硝酸纖維素膜,NC)表面,并保持其免疫活性,通過與相應(yīng)的抗體或抗原和酶標(biāo)記物的一系列免疫反應(yīng),形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物,在底物的參與下,結(jié)合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質(zhì),沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附的部位,呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色斑點(diǎn)。試驗(yàn)的結(jié)果可通過顏色斑點(diǎn)的出現(xiàn)與否和色澤深度進(jìn)行判定。

Dot-ELISA 在檢測和鑒定抗體方面比常規(guī)的血清學(xué)技術(shù)更加敏感[20],特別是用于檢測識別臨床意義抗體與傳統(tǒng)血清學(xué)檢測技術(shù)有相似或更高的靈敏性,可以用來檢測低濃度和弱親和力的抗體,增加了低濃度和弱親和抗體的檢測準(zhǔn)確度。進(jìn)一步改進(jìn)了血型檢測方法和改善輸血安全。用于檢測抗體的紅細(xì)胞膜的抗原性可以在反復(fù)凍融和-20 ℃保存11 個月的條件下不受影響,說明此方法非常穩(wěn)定,并可以長時間保存血型抗原,解決了長期保存和運(yùn)輸血型抗原問題。高穩(wěn)定性結(jié)果可提供更高的可靠性,從而進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化和控制程序。本研究建立的Dot-ELISA 方法,具有較高的準(zhǔn)確性,臨床樣本的檢測結(jié)果與現(xiàn)有的檢測方法符合率較高。在本研究中環(huán)形固定器所起到的作用是可以把NCM 膜固定到96 孔板的底部。把整個紅細(xì)胞膜固定到酶標(biāo)板上,建立檢測抗體的間接ELISA 方法,這樣可以用現(xiàn)在已經(jīng)商業(yè)化的ELISA 檢測分析儀器進(jìn)行檢測,進(jìn)而能夠達(dá)到自動化操作,節(jié)省人力,減少人為誤差和高通量檢測的目的。

總而言之,本研究所建立的Dot-ELISA 方法便捷易操作、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高,可作為輸血前檢測的有效方法,從而避免傳統(tǒng)試劑紅細(xì)胞的使用。