弓形蟲多態(tài)性GRA15 蛋白的研究進(jìn)展

馬葉婷，高文偉，周芃來，劉 卿，馬海利，張 鼎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西 太谷030801)

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii,T.gondii)是引起人獸共患弓形蟲病的專性胞內(nèi)寄生原蟲,幾乎能感染所有的溫血動物[1-2]。全球約有三分之一的人口感染弓形蟲,我國平均人群弓形蟲感染率為7.88%[3-4]。感染弓形蟲后,雖然免疫功能正常的人無明顯癥狀,但是免疫功能低下者會遭受嚴(yán)重的傷害甚至死亡[5]。例如,孕婦感染弓形蟲后,可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎及嬰幼兒的先天性弓形蟲病[6]；兒童感染弓形蟲后,一般表現(xiàn)為雙眼失明、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎及急性腦炎等。同時,弓形蟲的感染也會增加罹患精神分裂癥的風(fēng)險,是精神分裂癥的致病因素之一[7]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,弓形蟲可導(dǎo)致懷孕家畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎,嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致動物死亡,增加動物的患病率、死亡率和治療成本,給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。另外,弓形蟲感染在導(dǎo)致肉、奶、蛋、毛等產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量下降,即對養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失的同時,污染的動物食品和制品等也會隨著人類的消費(fèi)將蟲體傳播給人類。鑒于此,弓形蟲病的防控及病原研究在公共衛(wèi)生和畜牧生產(chǎn)上均具有重要意義。

弓形蟲感染宿主細(xì)胞離不開其分泌的微線體蛋白(Microneme proteins, MICs)、棒狀體蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)和致密顆粒蛋白(Dense granule antigens,GRAs)等[9]。這些效應(yīng)因子在蟲體粘附、入侵、宿主細(xì)胞內(nèi)增殖和逸出等過程發(fā)揮著重要的作用[10-13]。通過數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)等分析手段發(fā)現(xiàn),其中一些效應(yīng)因子具有多態(tài)性,是決定不同基因型弓形蟲毒力差異的重要因素。目前鑒定出的弓形蟲多態(tài)性蛋白有ROP5、ROP16、ROP18、GRA2 和GRA15 等。目前已有較多關(guān)于對弓形蟲RH、GT1 和PRU 蟲株GRA15 蛋白功能的比較分析的報道[14-15]。本文就弓形蟲GRA15蛋白的結(jié)構(gòu)、在蟲體與宿主互作中的作用、免疫保護(hù)性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為深入研究弓形蟲不同基因型蟲株的致病分子機(jī)制提供背景資料。

1 GRA15 蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

ToxoDB 數(shù)據(jù)庫(http://toxodb.org/toxo/)及相關(guān)研究顯示,弓形蟲多態(tài)性GRA15 蛋白氨基酸序列長度有4 種,分別為278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa(見表1)。I 型蟲株GRA15 蛋白多態(tài)性豐富,其不同蟲株GRA15 蛋白氨基酸序列長度包括以上278 aa、312 aa、550 aa 及635 aa 4 種(見表1)。由于編碼時存在移碼,I 型RH-ERP 蟲株和RH-JSR 蟲株的GRA15 基因分別編碼312 和278 個氨基酸[15]；其他I 型蟲株GRA15 基因分別編碼550 或635 個氨基酸[16]。II 型蟲株GRA15 基因編碼550 個氨基酸,III 型蟲株GRA15 基因編碼635 個氨基酸。長度為550 aa 的GRA15 蛋白比長度為635 aa 的GRA15 蛋白缺失85 個氨基酸,其中84 個位于C端,1 個位于N 端。另外,還有5 個位點(diǎn)的氨基酸不同(見表1)。

表1 弓形蟲不同基因型蟲株的GRA15 蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

對II 型蟲株GRA15 蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,其有一個跨膜區(qū)和一個PEXEL 樣的motif。PEXEL 樣的motif 在瘧原蟲上可作為分選信號指導(dǎo)蟲體蛋白進(jìn)入宿主的紅細(xì)胞。相反,PEXEL 樣的motif 在弓形蟲上不是指導(dǎo)蟲體蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞,而是能夠增強(qiáng)蛋白定位到納蟲囊泡膜上的能力[17]。據(jù)報道,II 型PRU 蟲株GRA15 蛋白可以定位到宿主細(xì)胞核內(nèi),這說明弓形蟲PRU 蟲株很可能存在剪切GRA15 蛋白PEXEL 樣的motif 的機(jī)制[18]。

2 GRA15 蛋白對宿主細(xì)胞的影響

2.1 對NF-κB 細(xì)胞信號通路的影響 Rosowski等[14]對北美及歐洲流行的RH-ERP 強(qiáng)毒株和PRU弱毒株GRA15 蛋白功能進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)PRU弱毒株GRA15 蛋白在蟲體對宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用,即能夠高水平引起宿主細(xì)胞NF-κB 信號通路的激活。激活機(jī)制很可能是,首先PRU 蟲株的GRA15 蛋白跟IKK-β 或TRAF6 形成復(fù)合體,引起IκB 的磷酸化和降解；之后引起p50 和p65 或c-Rel/p50 二聚體向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,最終影響了一系列的與免疫、凋亡及炎癥相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[19]。

PRU 蟲株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路引起的變化包括導(dǎo)致宿主細(xì)胞分泌IL-12,IL-12 又會刺激自然殺傷細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ,從而使宿主能更好的抵抗弓形蟲感染；另外,GRA15蛋白激活宿主的NF-κB 信號通路后,引起單核細(xì)胞分泌IL-1β,而IL-1β 是調(diào)節(jié)炎癥極其重要的分子[20]。PRU 蟲株的GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路可以使巨噬細(xì)胞向M1 方向極化,而將此巨噬細(xì)胞給小鼠接種后能夠明顯降低血吸蟲感染引起的肝纖維化[21],這提示,PRU 蟲株的GRA15 蛋白可作為潛在的治療肝纖維化藥物；而將此巨噬細(xì)胞給小鼠接種后還能夠明顯抑制體內(nèi)腫瘤的生長,這提示,PRU 蟲株GRA15 蛋白有作為新的治療手段來增強(qiáng)宿主免疫力并抵抗腫瘤的潛力[22]。據(jù)報道,PRU 蟲株的GRA15 蛋白還能夠增強(qiáng)宿主對蟲體的抵抗力和減輕腸道中由弓形蟲感染引起的炎癥[23]。

然而,與PRU 蟲株GRA15 蛋白相比,RH-ERP強(qiáng)毒株GRA15 蛋白僅具有微弱激活宿主NF-κB信號通路的作用,并且采用NF-κB 熒光素酶報告系統(tǒng)對該種程度的激活作用進(jìn)行檢測時,檢測不到酶活力[15]。這是由于RH-ERP 蟲株GRA15 蛋白編碼時移碼,是非功能性蛋白。基于RH-ERP蟲株以上遺傳背景,Yang 等[15]將GRA15GT1基因?qū)隦H-ERP 蟲株構(gòu)建RH-ERP+GRA15 GT1 互補(bǔ)株并感染NF-κB 信號報告細(xì)胞,結(jié)果表明,RH-ERP+GRA15GT1互補(bǔ)株能夠明顯引起NF-κB 報告基因表達(dá),這說明GRA15 GT1 蛋白能夠高水平激活宿主NF-κB 信號通路。盡管GT1 強(qiáng)毒株感染細(xì)胞后能夠引起NF-κB 信號通路改變,但是其激活NF-κB信號通路作用比PRU 弱毒株弱2 ～3 倍。一種可能是GRA15GT1蛋白受到GT1 蟲株其他基因的抑制作用,導(dǎo)致功能減弱。另一種可能是GRA15GT1蛋白比GRA15PRU蛋白多了85 個氨基酸和5 個位點(diǎn)的氨基酸存在不同導(dǎo)致的。相關(guān)研究表明,弓形蟲GT1 蟲株GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路的結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?94 ～518 氨基酸殘基[19]。 另外,Wei 等[24]將 弓 形 蟲 Ctwh3 蟲 株 的 GRA15(GRA15Ctwh3)蛋白轉(zhuǎn)染絨毛膜癌JEG-3 細(xì)胞發(fā)現(xiàn),GRA15Ctwh3蛋白可通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡。

2.2 對宿主其他方面的影響 PRU 蟲株GRA15 蛋白還能招募p65 鳥苷酸結(jié)合蛋白1(GBP1)聚集于納蟲囊泡膜上,破壞納蟲囊泡從而殺滅弓形蟲。這種招募機(jī)制不依賴于GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路,因?yàn)镚BP1 蛋白是在感染后1 小時聚集,而GRA15 蛋白激活NF-κB 信號通路發(fā)生在感染后4小時[25]。

3 與GRA15 蛋白互作的宿主蛋白

通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn),PRU 蟲株GRA15蛋白能夠與小鼠Luzp1 蛋白互作[26]。 而小鼠Luzp1 蛋白具有3 個核定位序列且能夠作為Two-A-containing histone acetyltransferase(ATAC)和Mediator complex(MED)的橋梁分子,從而形成穩(wěn)定的Meta-coactivator complex(MECO)復(fù)合體,該復(fù)合體是一些非編碼RNA 的調(diào)節(jié)因子[27-28]。這很可能表明弓形蟲PRU 蟲株通過借助GRA15 蛋白與宿主Luzp1 蛋白的相互作用定位到細(xì)胞核。另外,也不排除PRU 蟲株的GRA15PRU蛋白通過與宿主Luzp1 蛋白的相互作用,以干擾宿主的Luzp1 蛋白行使正常功能的可能性。另外,據(jù)報道,PRU 蟲株的GRA15 蛋白很可能跟IKK-β 或TRAF6 形成復(fù)合體[14]。

4 GRA15 的免疫保護(hù)作用

目前弓形蟲病的治療主要依賴化學(xué)藥物,但是存在耐藥性、藥物殘留及不能有效殺死細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲包囊等問題。因此,關(guān)于弓形蟲病的疫苗研究一直是科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。目前弓形蟲僅有用于綿羊免疫接種的S48 弱毒蟲株疫苗Toxovax?[29]。近年來,弓形蟲的基因工程疫苗成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。Chen 等[30]將PRU 蟲株GRA15基因構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-GRA15,對昆明種小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果顯示,PRU 蟲株GRA15 蛋白能夠引起較強(qiáng)的Th1 型免疫應(yīng)答；與對照組比較,免疫小鼠的存活時間延長,腦包囊數(shù)量減少。李曼[31]將弓形蟲Chinese I 型Wh3 株的GRA15 構(gòu)建真核重組表達(dá)載體WH3-GRA15-GFP,對BALB/c 小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果顯示,WH3 蟲株GRA15 蛋白不能有效誘發(fā)BALB/c 小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫。例如,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較IFN-γ 水平?jīng)]有明顯升高。但是從GRA15蛋白能夠激活NF-κB 信號通路的角度來說,GRA15 蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后會引起IFN-γ 水平升高。因此,弓形蟲GRA15 蛋白能否作為疫苗候選分子需要進(jìn)一步的研究,比如增加接種的劑量和改變接種的部位等。另外,GT1 蟲株GRA15蛋白是否能夠作為疫苗候選分子也需要進(jìn)行研究。

5 展望

弓形蟲GRA15 蛋白是具有多態(tài)性的重要的毒力因子。至今,關(guān)于其對宿主細(xì)胞信號通路的影響、在蟲體與宿主蛋白互作中的作用及功能的初步應(yīng)用的研究較多。但是,研究的焦點(diǎn)集中在弓形蟲PRU 弱毒株GRA15 蛋白,而對弓形蟲強(qiáng)毒株GRA15 蛋白的研究相對較少,例如,GT1 蟲株。此外,弓形蟲PRU 弱毒株GRA15 蛋白是否真正的能應(yīng)用于抗肝纖維化和抗癌,需要進(jìn)一步的研究。今后,相信隨著對弓形蟲各蟲株GRA15 蛋白研究的全面深入,將會為防治弓形蟲病及其他疾病奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。