金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞免疫器官T 淋巴細胞及其亞群以及B 淋巴細胞的影響

王洪梅，宋洋洋，于浩然，李天琦，劉 微，葛 銘

(1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱150030；2.黑龍江省教育廳動物普通疾病防治重點實驗室,黑龍江 哈爾濱150030)

雞新城疫(ND)是由副黏病毒科腮腺炎病毒屬的新城疫病毒引起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的高度接觸性、急性、敗血性傳染病,被世界動物衛生組織(OIE)列為A 類傳染病。隨著抗病毒中藥的開發,發現許多中藥具有預防和治療ND 的作用。本試驗通過金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞免疫器官T 淋巴細胞及其亞群以及B 淋巴細胞的影響試驗,研究結果表明,金銀花復方制劑能夠有效地抵抗NDV 感染,為臨床上研發防治新城疫中藥制劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草,購自黑龍江省哈爾濱中藥大市場。

1.2 病毒 雞新城疫病毒(Mukteswar I 系),由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈,EID50為10-4.5。

1.3 試驗動物 1 日齡海藍白蛋雛雞105 只,雌雄各半,購自某孵化廠。

1.4 金銀花復方制劑的制備 準確稱取金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草各150 g,先將藥物放入不銹鋼鍋內用清水浸泡1 h,加水量要淹沒過藥物3 cm,之后用武火先將浸泡好的連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草煎煮,15 min 后加入金銀花直至煮沸,再改用文火維持藥物沸騰,繼續煎煮40 min,用紗布將藥汁過濾收集,再加適量清水繼續煎煮,水量淹沒過藥物即可,煎煮火候同前,沸騰后再煎煮30 min,用紗布過濾藥汁,將兩次收集的藥汁混合濃縮至150 mL,將濃縮液12 000 r/min 離心20 min,取上清液,用生理鹽水定容至50 mL。

1.5 主要試劑 雞淋巴細胞分層液(密度為1.077±0.001 g/mL)、優級胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)；細胞培養液RPMIl640(GIBCO公司)；L-谷氨酰胺(Amresco 公司)；Hepes、臺盼蘭(Sigma 公司)；2-巰基乙醇(浙江黃巖東門化工廠)；鼠抗雞CD3-FITC 單抗、鼠抗雞CD4-PE 單抗、鼠抗雞CD8-CY5 單抗、鼠抗雞Bu-1a-PE 單抗(SouthernBiotech 公司)；PBS(pH 值7.2 ～7.4)緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.6 試驗動物分組及處理 105 只海藍白1 日齡雛雞飼養至21 日齡,隨機抽取15 只,翅靜脈采血,用瓊脂擴散法檢測NDV 母源抗體為陰性,隨機分成3 組,每組35 只,即對照組C 組、NDV 感染組I 組和NDV 感染金銀花復方制劑治療組T 組。I 組和T 組雛雞經眼、鼻、口人工感染NDV,0.2 mL/只,C 組雛雞經相同途徑給予相同劑量的PBS。T 組雛雞于感染后6 h 飲服金銀花復方制劑治療,劑量為1mL/只,每天給藥1 次,給藥方式為自由飲水,飲水前3 ～4 h 停水,連續7 d；I 組雛雞為不治療對照組,在人工感染NDV 后不應用任何藥物治療。以上各組雛雞分別嚴格隔離飼養。

1.7 試驗材料采取及處理 各組分別于感染后第1、3、5、7、14、21、28 天取材。每組每次隨機抽取5 只雛雞,稱重,心臟采血處死,分別做如下處理:

無菌快速采取免疫器官(胸腺、脾臟、腔上囊),部分制成單細胞懸液,用于組織細胞培養、T 淋巴細胞及其亞群和B 淋巴細胞數量檢測。

1.8 免疫器官(胸腺、脾臟)T 淋巴細胞及其亞型數量測定 無菌快速采取胸腺、脾臟,用尼龍網(200目)研磨擠壓制成單細胞懸液,細胞懸浮于RPMI1640 完全培養液(以下統稱為RPMI1640 培養液,內含200 IU/mL 青霉素、200 μg/mL 鏈霉毒、10%滅活胎牛血清、20 mmol/L Hepes、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5×10-5mol/L 2-巰基乙醇)。淋巴細胞分離液密度梯度離心法(400 r/min 離心20 min)分離胸腺、脾淋巴細胞,再用RPMI1640 培養液離心洗滌(350 r/min 離心,15 min)3 次,用臺盼蘭拒染法檢測細胞活力＞95%,同時進行細胞計數,調細胞濃度為1×107/mL,吸取制備好的胸腺及脾臟淋巴細胞懸液100 μL 分別到1.5 mL 的Eppendorf 管中,再分別向兩管中同時加入10 μL CD3+單抗、CD4+單抗和CD8+單抗,充分混勻,避光4 ℃孵育30 min,每管加PBS 1 mL,4 ℃下1 500 r/min 離心5 min,棄上清液后再加入PBS 后上流式細胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+量,并計算CD4+/CD8+值。

1.9 免疫器官(脾臟、腔上囊)B 淋巴細胞數量測定 無菌快速采取脾臟、腔上囊,制備脾臟、腔上囊淋巴細胞懸液,調細胞濃度為1×107/mL,吸取制備好的脾臟及腔上囊淋巴細胞懸液100 μL 分別到1.5 mL的Eppendorf 管中,再分別向兩管中同時加入10 μL Bu-1a 單抗,充分混勻,避光4 ℃孵育30 min,每管加PBS 1mL,4 ℃下1 500 r/min 離心5 min,棄上清液后再加入PBS 后上流式細胞儀測定Bu-1a 量。

1.10 數據處理 結果以平均值±標準誤(x±sx)表示,統計分析用SPSS 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果

2.1 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD3+標記的T 淋巴細胞的影響 從表1 可見,NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD3+標記的T 淋巴細胞數較對照組雛雞不同程度減少,感染后3 ～14 d 明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組與金銀花復方制劑治療組胸腺CD3+標記的T 淋巴細胞數相比較于感染后5 ～7 d明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～14 d,脾臟CD3+標記的T 淋巴細胞數均不同程度的低于對照組雛雞,感染后3 ～7 d 明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞感染NDV 后5 ～7 d 脾臟CD3+標記的T 淋巴細胞數明顯低于金銀花復方制劑治療組雛雞(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表1 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD3+標記的T 淋巴細胞的影響/%

2.2 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD4+T 淋巴細胞亞群的影響 從表2 可見,NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD4+T 淋巴細胞亞群數均不同程度的低于對照組雛雞與金銀花復方制劑治療組雛雞,其中感染后3 ～14 d 與對照組雛雞相比胸腺CD4+T 淋巴細胞亞群數明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01),感染后5 ～14 d 胸腺CD4+T 淋巴細胞亞群數明顯低于金銀花復方制劑治療組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～14 d,脾臟CD4+T 淋巴細胞亞群數與對照組雛雞相比不同程度的降低,感染后5 ～7 d 明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞與金銀花復方制劑治療組雛雞相比較于感染后5 ～7 d 顯著下降(P ＜0.05)。

表2 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD4+T 淋巴細胞亞群的影響/%

2.3 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD8+T 淋巴細胞亞群的影響 從表3 可見,NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD8+T淋巴細胞亞群數不同程度的低于對照組雛雞,其中于感染后3 ～7 d 顯著低于對照組(P ＜0.05)；NDV感染組雛雞感染NDV 后14 d,胸腺CD8+T 淋巴細胞亞群數明顯低于金銀花復方制劑治療組(P ＜0.05)。NDV 感染組雛雞感染NDV 后3 ～14 d,脾臟CD8+T淋巴細胞亞群數均不同程度的低于對照組雛雞,感染后3 ～7 d 明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞感染NDV 后7 d 脾臟CD8+T 淋巴細胞亞群數顯著低于金銀花復方制劑治療組(P ＜0.01)。

2.4 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群比值的影響 從表4 可見,NDV 感染組雛雞胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值于感染NDV 后3 ～21 d 不同程度的低于對照組雛雞,感染后5 ～7 d 顯著降低(P ＜0.05),其余天數未見統計學差異(P ＞0.05)；金銀花復方制劑治療組雛雞感染NDV 后14 ～21 d,胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值明顯高于對照組雛雞(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞與金銀花復方制劑治療組雛雞相比較于感染后7 ～21 d胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染組雛雞脾臟CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值于感染NDV后3 ～14 d 不同程度的低于對照組雛雞,感染后7 d顯著降低(P ＜0.05)；金銀花復方制劑治療組雛雞感染NDV 后5 ～7 d 脾臟CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值明顯高于對照組雛雞(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞感染NDV 后5 ～14 d 脾臟CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群的比值明顯低于金銀花復方制劑治療組雛雞(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表3 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD8+T 淋巴細胞亞群的影響/%

2.5 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞脾臟及腔上囊B 淋巴細胞的影響 從表5 可見,NDV感染組雛雞感染NDV 后3 ～28 d,脾臟B 淋巴細胞數不同程度的低于對照組雛雞,感染后3 ～14 d明顯低于對照組雛雞(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染組雛雞與金銀花復方制劑治療組雛雞相比于感染后5 ～7 d 脾臟B 淋巴細胞數明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。 NDV 感染組雛雞感 染NDV 后3 ～28 d,法氏囊B 淋巴細胞數不同程度的低于對照組雛雞,感染后3 ～7 d 明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01),其余天數未見統計學差異(P ＞0.05)；NDV 感染組雛雞感染NDV 后5 ～7 d 腔上囊B 淋巴細胞數顯著低于金銀花復方制劑治療組雛雞(P ＜0.05)。

表4 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞胸腺及脾臟CD4+T/CD8+T 淋巴細胞亞群比值的影響/%

表5 金銀花復方制劑對人工感染NDV 雛雞脾臟及腔上囊B 淋巴細胞的影響/%

3 討論

試驗所用金銀花復方制劑包括金銀花、連翹、魚腥草、黃芪、白術、甘草等。該方劑以金銀花、連翹、魚腥草為主藥；黃芪、白術為輔藥；甘草為佐藥。研究發現,金銀花和連翹具有顯著的抗炎和抗病毒的作用；魚腥草具有抗菌和增強免疫功能的作用；黃芪可以增強機體的免疫功能；白術能促進T 淋巴細胞增殖、分化,改變T 淋巴細胞亞群比例；甘草具有解毒、補中益氣、調和諸藥的作用[1-5]。

有報道稱魚腥草能夠顯著提高外周血T 淋巴細胞的比例,增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力,促進綿羊紅細胞免疫所致的IgM 的生成,從而可以提高機體的特異性免疫能力[6]。郝鈺等證實黃芪多糖可通過增強淋巴細胞與內皮細胞的粘附而促進淋巴細胞再循環,增加淋巴細胞與抗原的接觸機會,從而擴大免疫反應,增強機體免疫功能[7]。還有報道指出,白術能夠提高大鼠腹部手術后的脾細胞中的CD3+、CD4+、CD8+百分率,促進動物的免疫功能恢復[8]。潘曌曌等通過試驗對幾種常用的中草藥進行體外抗內毒素效力比較,結果表明,以連翹、雙花作用為最強[9]。本試驗中金銀花復方制劑治療組雛雞胸腺及脾臟CD3+標記的T 淋巴細胞數、CD4+T 淋巴細胞數及脾臟和腔上囊B 淋巴細胞數均于感染NDV 后3 d不同程度的回升,并且感染后3 ～28 d 不同程度的高于NDV 感染組雛雞,感染后期接近對照組雛雞水平,與已報道由金銀花、連翹和黃芩組成的雙黃連粉針劑能夠提高免疫器官淋巴細胞及其亞群數的結果相一致[10]。表明金銀花復方制劑可增加免疫T 淋巴細胞數量,可以提高免疫器官中CD4+T 淋巴細胞含量,能夠促進腔上囊產生B 淋巴細胞,提高機體的免疫功能。

CD8+T 淋巴細胞屬于抑制性T 淋巴細胞,在免疫細胞之間的調控中起重要作用[11]。本試驗感染組雛雞通過治療后CD8+T 淋巴細胞數量升高,表明金銀花復方制劑具有增強免疫器官CD8+T 淋巴細胞的作用,從而增強了機體的細胞免疫能力。

CD4+/CD8+比值是評價機體免疫狀態的重要指標,其比值的高低,表明機體所處免疫狀態的高低。雛雞感染NDV 后,胸腺及脾臟CD4+/CD8+比值分別于感染后3 ～21 d、3 ～14 d 不同程度的低于對照組雛雞,表明NDV 可降低機體的免疫能力,使機體處于較低的免疫狀態下,金銀花復方制劑治療組雛雞胸腺及脾臟在感染后3 ～28 d、5 ～21 d 不同程度的高于對照組和NDV 感染組雛雞,表明金銀花復方制劑能提高免疫器官CD4+/CD8+比值,增強機體抵抗NDV 的能力。