重組豬源IFN-λ1 植物乳桿菌的構建與表達驗證

付婷婷，馬彬堯，王茂鵬，韓繼成，許 汪，陳 競，姜宇航，金寧一，李 昌

(1.揚州大學獸醫學院,江蘇 揚州225009；2.軍事醫學研究院軍事獸醫研究所,省部共建吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,吉林 長春130122；3.溫州大學病毒學研究所,浙江 溫州325000)

干擾素(Interferon,IFN)是一類干擾病毒復制和感染產生的細胞因子。根據生物學活性可分為3類,Ⅰ型是由病毒誘導白細胞和纖維母細胞產生的α 和β 干擾素；Ⅱ型是由病毒誘導淋巴細胞產生的γ 干擾素；Ⅲ型干擾素(也稱為IFN-λs 或IL-28/29)是2003 年發現的新類型,在結構和遺傳上同IL-10家族成員相似,但顯示Ⅰ型IFN 樣活性,主要通過JAK-STAT 信號通路,發揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用[1-2]。目前人源Ⅲ型干擾素有IFN-λ1、IFNλ2、IFN-λ3 和IFN-λ4,鼠源Ⅲ型干擾素包含IFN-λ2和IFN-λ3,豬源Ⅲ型干擾素僅有IFN-λ1 和IFN-λ3兩種被克隆和表達[3-4]。Lin Li 等發現,豬源IFNλ1 主要作用于腸黏膜上皮細胞并表現強大的抗病毒活性,對PEDV 感染具有較強的抑制作用[5]。Lan F 等發現,IFN-λ1 有利于健康鼻黏膜中金黃色葡萄球菌的清除,并通過IFN-λ1-IL-28R-ROS-JAK-STAT信號通路增強巨噬細胞的抗菌功能[6]。IFN-λs 受體表達主要在上皮細胞,包括表皮、呼吸道和胃腸道上皮細胞。相對于Ⅰ型干擾素,Ⅲ型干擾素由于其受體(IFN-λs)的靶向優勢,其引起的副作用相對較小。另外,IFN-λs 是黏膜、上皮組織中抗病毒反應的重要介質,并且對GI 上皮的保護至關重要,可能是靶向黏膜感染的潛在抗病毒治療劑,同時也在黏膜免疫中發揮重要作用[7-8]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)作為一種被公認為安全(Generally regarded as safe,GRAS)的益生菌,在生物醫學LAB 應用方面,包括LAB 佐劑、免疫刺激劑和治療藥物遞送系統。其中植物乳桿菌對腸道上皮細胞的粘附作用有助于在腸道定植,抑制病原菌在腸道定植和增強植物乳桿菌與腸道細胞之間的信號交流。近年來,乳桿菌作為基因工程菌逐漸受到廣泛應用。如干酪乳桿菌表達PEDV的N 蛋白[9],羅伊氏乳桿菌表達霍亂弧菌的CTB 蛋白[10]。本試驗基于植物乳桿菌作為表達異源蛋白的優勢菌,選用植物乳桿菌Lp18 表達含植物乳桿菌錨定信號肽(1320 信號肽)的豬源IFN-λ1 基因,選擇乳球菌NZ3900 作為克隆中間宿主；再使用植物乳桿菌Lp18 作為表達宿主菌構建表達豬源IFN-λ1的重組菌,為豬源IFN-λ1 的開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌株 質粒DNA 小量提取試劑盒、Bioflux 凝膠回收試劑盒,購自蘇州康寧生命科技有限公司；MRS、M17 培養基,購自海博生物公司；His單抗、HRP 標記抗鼠二抗和FITC 標記抗鼠二抗,購自Protein 公司；Clone Express Multis One Step Cloning Kit 和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,購自Vazyme 公司；誘導肽SppIP 于南京金斯瑞生物科技公司合成；植物乳桿菌Lp18、乳酸乳球菌NZ3900 由本實驗室保存；pSIP411 載體由山東大學祁慶生教授贈予；含優化的pIFN-λ1 基因由本實驗室合成并保存。

1.2 引物設計及合成 根據GenBank 中基因序列(FJ455508.1),利用Primer5.0 軟件設計引物和用于擴增基因序列,引物pIFN-λ1-F 和pIFN-λ1-R 用于擴增IFN-λ1 序列,片段長度為650 bp；通用引物SF 和SR 用于篩選陽性菌落；引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物序列

1.3 pIFN-λ1 基因的擴增 以本試驗保存的pIFNλ1 基因為模板,進行PCR 擴增。反應體系:KOD Plus 0.5 μL、模板1 μL、引物pIFN-λ1-F 和pIFN-λ1-R 各1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2.5 μL、MgSO41 μL、ddH2O 補足25 μL。反應條件:95 ℃2 min,58 ℃30 s,72 ℃1 min,共30 個循環。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并按照膠回收試劑盒進行回收產物。

1.4 重組菌表達質粒的構建及鑒定 采用無縫克隆技術將1.3 的膠回收產物連接到pSIP411 載體中,電轉化到克隆宿主乳球菌NZ3900 中,涂布于(紅霉素濃度為25 mg/L)的M17 固體平板上,30 ℃培養過夜；挑取單個菌落用通用引物SF 和SR 進行克隆PCR 檢測,驗證正確后送至公司測序。提取正確的重組表達質粒再次電轉入植物乳桿菌Lp18,涂布于(紅霉素濃度為25 mg/L)的MRS 固體平板上,37 ℃培養過夜；挑取單個菌落用通用引物SF 和SR進行克隆PCR 鑒定。

1.5 重組植物乳桿菌的誘導表達 挑取陽性重組植物乳桿菌Lp18:pSIP-pIFN-λ1 及植物乳桿菌Lp18分別1%接種于MRS 液體培養基(紅霉素濃度為25 mg/L),當OD 值為0.3 ～0.5 時,添加SppIP(濃度為50 μg/L),繼續培養10 h。4 000 r/min 離心收集菌體,用PBS 清洗用以去除MRS 培養基,再用PBS 重懸菌體。加入玻璃珠使用研磨機進行研磨,收集蛋白液體,-80 ℃保存備用。

1.6 重組植物乳桿菌表達產物的Western Blot 鑒定 取-80 ℃保存的蛋白液體適量,加入5×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻,沸水煮6 ～8 min。12%SDS-PAGE 電泳后,通過半干式轉膜轉印PVDF 膜上用于Western Blot 分析:5%脫脂乳室溫封閉3 h,PBST 洗3 次；1∶5 000 His 標記抗鼠一抗進行4 ℃過夜孵育,PBST 洗3 次；HRP 標記的抗鼠二抗孵育1 h,PBST 洗3 次；ECL 顯影觀察并拍照。

1.7 外源基因表達條件的優化 為獲得植物乳桿菌表達最佳的pIFN-λ1 蛋白,進行重組植物乳桿菌不同表達條件的摸索。選擇不同誘導時間的優化,在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h 時間點進行制備蛋白樣品,對其進行Western Blot 檢測。

1.8 外源基因表達的免疫熒光分析 1%重組植物乳桿菌接種于液體MRS 培養基中(紅霉素濃度為25 mg/L),培養10 h 后收集菌體用等量PBS 洗2遍。一抗用含1∶50 的鼠源Anti-His 標簽抗體孵育過夜,PBS 清洗5 遍,FITC 標記的二抗1∶200 孵育2 h,PBS 清洗5 遍。進行制片,油鏡下觀察外源基因的表達情況。

1.9 外源基因表達的流式細胞分析 1%重組植物乳桿菌接種于液體MRS 培養基中(紅霉素濃度為25 mg/L),培養10 h 后收集菌體用等量PBS 洗2遍。一抗用含1∶50 的鼠源Anti-His 標簽抗體孵育過夜,PBS 清洗5 遍,FITC 標記的二抗1:200 孵育2 h,PBS 清洗5 遍。取適量PBS 重懸菌體用于流式細胞儀。

2 結果

2.1 目的基因的擴增與鑒定 PCR 擴增產物pIFNλ1 片段經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得了1 條約650 bp 的特異條帶,與預期大小相符合(圖1)。

圖1 pIFN-λ1 基因PCR 擴增產物

2.2 重組表達質粒的構建與鑒定 通過無縫克隆技術構建含有pIFN-λ1 的重組質粒Lp18:pSIPpIFN-λ1(圖2),將該質粒電轉入克隆宿主菌乳球菌NZ3900 后,在含有紅霉素抗性的平板上挑取多個單克隆,提取陽性質粒送公司測序鑒定。經公司測序正確后,重組質粒再次電轉入表達宿主菌植物乳桿菌Lp18 中,挑取3 個單克隆進行菌液PCR 鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳可見1 552 bp 目的條帶,與預期相符合(圖3)。表明重組質粒成功電轉入植物乳桿菌Lp18 中,驗證正確的重組植物乳桿菌命名為Lp18:pSIP-pIFN-λ1。

圖2 重組質粒pSIP-pIFN-λ1 示意圖

圖3 重組植物乳桿菌Lp18：pSIP-pIFN-λ1 的驗證

2.3 外源基因表達的Western Blot 鑒定 將鑒定正確的重組植物乳桿菌進行誘導表達,加入SppIP(50 μg/L)誘導劑,再繼續培養10 h,植物乳桿菌Lp18 作為對照。結果表明,重組植物乳桿菌中未加誘導劑的蛋白中均未檢測到蛋白條帶,而重組pIFN-λ1 的植物乳桿菌加誘導劑可見27 kDa 左右的特異性條帶(圖4),表明pIFN-λ1 基因在植物乳桿菌Lp18 中成功表達。

圖4 Western Blot 檢測pIFN-λ1 蛋白在重組植物乳桿菌Lp18 中的誘導表達

2.4 外源基因表達時間的確定 為了更好的進行外源基因的表達,對重組植物乳桿菌Lp18:pSIPpIFN-λ1 誘導表達時間進行了確定。結果如圖5 所示,由圖可以看出,重組蛋白在4 h 就開始表達,且隨著重組植物乳桿菌培養時間的延長,重組蛋白的表達隨之提高,在18 h 時可持續表達,根據成本與時間,我們在后期研究中選用12 h 表達的蛋白進行相關研究。

圖5 Western Blot 檢測不同時間點對重組蛋白pIFN-λ1

2.5 外源基因表達的免疫熒光分析 通過免疫熒光,對表達的外源蛋白進行鑒定。由圖6 可知植物乳桿菌Lp18 未見熒光,而重組植物乳桿菌Lp18:pSIP-pIFN-λ1 可見單個菌體熒光,進一步表明目的基因能夠在植物乳桿菌Lp18 中表達,而且表達的外源基因可以展示到乳桿菌表面。

2.6 流式細胞分析 通過流式細胞術對植物乳桿菌Lp18 和重組植物乳桿菌Lp18:pSIP-pIFN-λ1 進行鑒定分析。 由圖7 可知植物乳桿菌Lp18 為4.31%,重組植物乳桿菌Lp18:pSIP-pIFN-λ1 的陽性率為22.96%。

圖6 免疫熒光鑒定重組菌表面表達

圖7 流式分析重組菌表達

3 討論

Ⅲ型干擾素作為一種黏膜型細胞因子在黏膜表面顯示出廣譜的抗病毒作用[11],是一種非常具有前景的臨床應用細胞因子。目前人源IFN-λ1 已應用于抗病毒和抗腫瘤且有上市治療產品[12],因此對于豬源IFN-λ1 的抗病毒黏膜作用有待深入研究。

植物乳桿菌作為基因工程菌具有天然優勢:較強的腸道上皮細胞的定植能力和粘附能力,對腸道黏膜免疫具有調節作用。因此植物乳桿菌作為基因工程菌表達異源蛋白近幾年來逐漸被應用,Yang等利用植物乳桿菌遞送FaeG-DCpep 融合抗原,并在小鼠中評估免疫應答反應[13],Fredriksen 等利用植物乳桿菌表面表達侵襲素細胞外結構域(D1-D5,D4-D5)來增加植物乳桿菌的促炎性質,并且當與細胞培養物中的單核細胞相互作用時,重組菌是NFkappaB 的有效激活劑[14]。劉永仕等利用植物乳桿菌NC8 表達豬源IFN-λ3,且重組菌顯著抑制PEDV在IPEC-J2 中的復制和ISGs 的高表達[15]。Lin Li等表明,pIFN-λ3 表現出比pIFN-λ1 更強效或至少相似的抗病毒活性對于特定腸上皮細胞中。豬源IFN-λ3 和IFN-λ1 僅有54.2%氨基酸相似性[16]。目前,并未見植物乳桿菌表達豬源IFN-λ1 蛋白的報道。

Karlakas 和Sorvig 等證實了優化pSIP 表達系統能夠高效表達異源蛋白[17-18],Wang 等使用植物乳桿菌表達pSIP411-VP1 重組質粒,也證實了pSIP411表達載體的高效性[19]。因此本研究選用高粘附性的宿主菌Lp18,通過優化pSIP411 表達載體及表達蛋白基因,成功表達豬源IFN-λ1 蛋白。通過1320信號肽將異源抗原表達于細胞表面,熒光檢測結果證明了其表面展示能力,這有助于刺激機體的免疫反應。豐富植物乳桿菌表達異源蛋白的可行性和為研究不同豬源IFN-λs 提供理論基礎。本研究通過摸索不同條件的表達情況來確定最佳的表達量,隨著時間增長IFN-λ1 蛋白表達量越高。優化的重組植物乳桿菌表達蛋白結合pIFN-λ 的抗黏膜病毒作用,可增強抗病毒效果。本研究成功構建了一株穩定表達的重組植物乳桿菌具有潛在黏膜免疫應用價值,為豬源IFN-λ1 的開發應用研究提供理論基礎。