布魯菌VirB1 2 基因的分泌表達(dá)及鑒定

張婷婷，劉夢(mèng)志，馮 生，孫創(chuàng)業(yè)，陳澤良，劉寶山，沈國(guó)順

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng)110866)

布魯菌病(Brucellosis,簡(jiǎn)稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的人獸共患慢性傳染病,羊、牛、豬等動(dòng)物最易感染,主要引起母畜傳染性流產(chǎn)[1]。人類由于接觸帶菌動(dòng)物或者食用病畜及其乳制品可引發(fā)感染[1]。目前該病流行于世界各個(gè)地方,發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)重。在中亞國(guó)家,人布病的流行形勢(shì)在不斷惡化[1-2],在我國(guó)也廣泛流行。近年來(lái),我國(guó)部分地區(qū)有再度流行的趨勢(shì)[3],給人們的日常生活和生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

布魯菌是胞內(nèi)寄生菌,抗菌藥物治療效果不顯著,很難根治,這就造成了該病的反復(fù)發(fā)作[11]。目前布病的防治主要以疫苗免疫為主,然而現(xiàn)有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想[4],而且疫苗免疫抗體和野毒感染抗體無(wú)法進(jìn)行區(qū)分,給養(yǎng)殖場(chǎng)的布病凈化帶來(lái)很大困難。在這種情況下,開(kāi)發(fā)新的基因缺失標(biāo)記疫苗成為熱點(diǎn)[5]。牛布魯菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19 株為親本株,缺失布魯菌IV 型分泌系統(tǒng)中VirB12 基因的基因缺失疫苗[6-7]。免疫動(dòng)物可以通過(guò)VirB12 蛋白抗體的存在與否來(lái)判斷區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體,彌補(bǔ)了以往疫苗的缺陷,有利于布病的預(yù)防和凈化,從而保護(hù)人的健康和安全。

VirB12 基因?qū)儆诓剪斁?IV 型分泌系統(tǒng)(T4SS)。 IV 型分泌系統(tǒng)由分別命名為VirB1-VirB12 的12 個(gè)不同的VirB 蛋白構(gòu)成,形成貫穿細(xì)菌壁和外膜的復(fù)合體,與布魯菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、復(fù)制、免疫應(yīng)答有關(guān)[8]。VirB12 蛋白在胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并且可作為一種布魯菌血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)記抗原[9]。本試驗(yàn)構(gòu)建了VirB12 的短小芽孢桿菌分泌型表達(dá)系統(tǒng),用以獲取大量VirB12蛋白,為建立基于VirB12 蛋白的檢測(cè)方法以區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料 布魯菌菌株和血清:布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,購(gòu)自中國(guó)生物制品鑒定所；A19-ΔVirB12 免疫陽(yáng)性血清和B.abrotus A19 菌株由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司贈(zèng)予。

1.2 載體及菌株 短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)試劑盒(Cat.#HB300),購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 抗體及試劑 6×His 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的蛋白G、2×Premix Taq、PVDF Immobilon-P Transfer Membranes、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ等,購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗牛二抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、膠回收試劑盒、DAB 顯色試劑盒等,購(gòu)自索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 上發(fā)表的牛型布魯菌(Brucella abrotus)VirB12 基因序列(Gen-Bank:AF226278.1),使用分子生物學(xué)軟件Prime premier 5.0 設(shè)計(jì)并合成了1 對(duì)引物:VirB12-F:5′-GATGACGATGACAAAGGATCCTCTCTGGCCGCTTGTTCC-3′(ggatcc 為BamHⅠ酶切位點(diǎn)),VirB12-R:5′-CATCCTGTTAAGCTTGTCGACTTACTTGCGTAAAATTTCGATATCC-3′(gtcgac 為Sal I 酶切位點(diǎn))。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟,引物兩端分別設(shè)計(jì)了重組克隆序列和限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 VirB12 基因的PCR 擴(kuò)增及回收 以牛布魯菌A19 的煮沸裂解產(chǎn)物為模板進(jìn)行VirB12 基因組的PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。做50 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖核酸凝膠電泳鑒定擴(kuò)增效果。

1.4.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收VirB12 目的條帶。按照短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)試劑盒的操作程序?qū)⒒厥蘸玫腣irB12 目的基因片段重組克隆到pBIC1 質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化到短小芽孢桿菌中,然后均勻涂布在含新霉素(50 μg/mL)的2SY 固體培養(yǎng)基平板。挑選克隆菌落,接種于含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提,然后對(duì)獲取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR 和雙酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

1.4.4 重組陽(yáng)性菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的VirB12 重組表達(dá)菌株接種于4 mL 含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液體培養(yǎng)基中,在30 ℃～33 ℃條件下120 r/min 振蕩培養(yǎng)72 小時(shí),進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后,取1 mL 的菌液5 000 r/min 離心5 min。分別取上清和沉淀樣品,用上樣緩沖溶液處理后通過(guò)15%SDS-PAGE 進(jìn)行鑒定。

1.4.5 重組蛋白的鑒定 菌液上清經(jīng)15% SDSPAGE 分離后,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,以1%的BSA 在37 ℃條件下封閉1.5 h,然后分別以6×His 單克隆抗體(1 ∶500 稀釋)及牛布魯菌陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清(1∶100 稀釋)作為一抗,以HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠血清(1∶1 000 稀釋)和HRP 標(biāo)記的山羊抗牛血清做二抗(1∶5 000 稀釋)孵育30 min,洗滌后用DAB 顯色,蒸餾水終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 VirB12 基因的擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后,在500 bp 附近出現(xiàn)了一條擴(kuò)增條帶(圖1),與預(yù)期目的片段519 bp 大小相符,表明擴(kuò)增出了VirB12 目的基因。

圖1 B12 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 提取克隆菌的質(zhì)粒,進(jìn)行BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切和PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,可看到在500 bp 附近都出現(xiàn)了基因片段(圖2),DNA 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST對(duì)比鑒定為布魯菌VirB12 序列。

圖2 pBIC1-B12 質(zhì)粒的鑒定

2.3 VirB12 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)15%SDS-PAGE 分析顯示,菌液上清中出現(xiàn)了特異的22 kDa 的蛋白條帶(圖3),與預(yù)期的目的蛋白大小相符,表達(dá)蛋白的含量高達(dá)80%。菌體沉淀中沒(méi)有明顯的條帶出現(xiàn),表明表達(dá)蛋白為分泌表達(dá)。

圖3 重組陽(yáng)性菌的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

2.4 VirB12 蛋白的鑒定 分別使用6His 單抗和牛布魯菌陽(yáng)性血清做一抗的Western-Blot 結(jié)果表明,在22 kDa 處均出現(xiàn)了顯著的免疫印跡條帶(圖4 A,B),位置和SDS-PAGE 電泳位置相符,而作為陰性對(duì)照的芽孢桿菌樣品沒(méi)有出現(xiàn)免疫印跡條帶,表明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為VirB12 的6×His 融合蛋白,其能與牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性；而以A19-ΔVirB12 免疫牛的陽(yáng)性血清做一抗的Western-Blot 中沒(méi)有出現(xiàn)該條帶(未展示),說(shuō)明A19-ΔVirB12 疫苗免疫的陽(yáng)性血清中不含有VirB12 蛋白的抗體。

圖4 B12 重組蛋白的鑒定

3 討論

布魯菌作為危害人獸安全與健康的病原菌之一,備受關(guān)注。布魯菌分為六個(gè)種屬19 個(gè)亞型,分別是馬耳他布魯菌(羊型布魯菌)3 個(gè)亞型、流產(chǎn)布魯菌(牛型布魯菌)8 個(gè)亞型、豬布魯菌5 個(gè)亞型、狗布魯菌1 個(gè)亞型、林鼠布魯菌1 個(gè)亞型和綿羊布魯菌1 個(gè)亞型。而且近幾年還發(fā)現(xiàn)了海洋種[1]。其中羊種、牛種、豬種和狗種布魯菌能夠通過(guò)受傷皮膚、黏膜直接感染人類,并引發(fā)一系列的臨床癥狀,嚴(yán)重危害人們的健康。

布魯菌是兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,能夠感染吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞,在感染哺乳動(dòng)物時(shí),巨噬細(xì)胞是主要的結(jié)合靶點(diǎn)[10]。其中T4ss 分泌系統(tǒng)參與布魯菌在胞內(nèi)的增殖。T4ss 分泌系統(tǒng)通過(guò)改變寄生細(xì)胞的細(xì)胞器來(lái)達(dá)到自我的復(fù)制[11]。VirB12 作為T(mén)4ss 分泌系統(tǒng)編碼的一個(gè)基因,能夠在感染細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生毒性蛋白[12],并且能夠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,可作為血清學(xué)標(biāo)記檢測(cè)布魯菌[9]。

盡管現(xiàn)有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想,但使用疫苗免疫接種仍然是防控布魯菌病最有效的方法,然而現(xiàn)有的疫苗無(wú)明顯的基因標(biāo)識(shí),無(wú)法從血清學(xué)水平來(lái)區(qū)別野毒感染和疫苗免疫血清,在這種情況下,開(kāi)發(fā)新的基因缺失標(biāo)記疫苗成為熱點(diǎn)[7]。牛布魯菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19株為親本株,缺失布魯菌IV 型分泌系統(tǒng)中VirB12基因的基因缺失疫苗[6],填補(bǔ)了現(xiàn)有弱毒疫苗和滅活疫苗無(wú)法在血清學(xué)水平來(lái)鑒別診斷布病野毒感染的缺陷。以其為抗原建立ELISA 方法,可以在只免疫A19-ΔVirB12 活疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)檢出野毒感染動(dòng)物。A19-ΔVirB12 活疫苗和VirB12 抗體ELISA 配套使用,可以凈化養(yǎng)殖場(chǎng)中的布病野毒,減少布病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失,保障人員安全。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了VirB12 蛋白的短小芽孢桿菌表達(dá)菌,可以在上清中大量表達(dá)具有反應(yīng)活性的VirB12 蛋白,含量達(dá)80%,方便制備和純化,為其應(yīng)用于布病野毒的篩檢做了前期準(zhǔn)備。