1 株西藏牦牛巴氏桿菌全基因組測序與比較基因組學分析

貢 嘎，羅潤波，陳建春，王一飛，索朗斯珠

(西藏農牧學院動物科學學院,西藏 林芝860000)

巴氏桿菌是革蘭陰性小桿菌,該病原菌分布廣泛。主要引起牛和水牛出血性敗血癥,主要為頭部和頸部水腫,淋巴結腫脹、出血。根據莢膜多糖抗原不同,多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E 型和F型5 個血清型；根據脂多糖抗原不同,可以分為1 ～16 個血清型[1]。本研究擬以本實驗室臨床分離的1 株牦牛巴氏桿菌菌株為研究材料,利用SMRT 方法對分離菌株進行全基因組測序,解析了西藏牦牛源巴氏桿菌菌株的全基因組序列。通過基因組學和比較基因組學對該菌株的基本特征進行了分析,為牦牛巴氏桿菌病的進一步研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 測序菌株:牦牛巴氏桿菌1 株,由本實驗室2016 年12 月從西藏林芝某地病死牦牛肺臟中分離,通過生化及PCR 鑒定,同時進行KM 小鼠致病性實驗和菌株莢膜血清分型(A),保存。

1.1.2 主要試劑 ExTaqDNA 聚合酶,dNTPs,DNA Marker、10%新生牛血清、TSA 培養基、細菌基因組提取試劑盒等試劑,購自武漢科前動物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌全基因組的提取、測序及序列組裝 用細菌基因組提取試劑盒進行基因組的提取。通過SART法對牦牛源巴氏桿菌全基因組測序、應用組裝軟件Canu[2-4]對過濾后的Subreads 數據進行組裝。組裝工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.2 牦牛巴氏桿菌完整基因組注釋與分析

(1)編碼基因預測:通過軟件Prodigal[5]對組裝后的基因組進行編碼基因預測；(2)重復序列預測:使用Repeat Masker[6]軟件對細菌基因組進行重復序列的預測；(3)非編碼RNA 預測:使用軟件tRNAscan-SE[7]預測基因組中的 tRNA,使用軟件 Infernal 1.1[9]基于Rfam[9]數據庫預測基因組中的rRNA；(4)假基因預測:通過軟件GenBlastA[8]比對,在基因組上尋找同源的基因序列(可能的基因),然后利用軟件GeneWise[9]尋找基因序列中的不成熟的終止密碼子及移碼突變,預測測序菌株的假基因。

1.3 牦牛巴氏桿菌比較基因組學分析

1.3.1 基因組共線性分析 使用軟件MCScanX[10]根據共線性關系對測序樣品與參考基因組進行分析。

1.3.2 基因家族與特有基因分析 使用OrthoMCL軟件對測序菌株預測出的蛋白序列和參考基因組的蛋白序列進行家族分類,之后對于基因家族進行分析,包括統計分析菌株特有的基因家族,菌株共有的基因家族。

1.3.3 物種間進化關系分析 使用測序物種與參考物種均為單拷貝的基因家族中的基因,利用PhyML[11]軟件構建進化樹,研究物種間的進化關系。

2 結果

2.1 所測牦牛巴氏桿菌的基本特征 本研究測定的巴氏桿菌菌株于2016 年分離自西藏牦牛,為A 型莢膜牛巴氏桿菌。

2.2 測序及組裝結果 組裝得到總長2 297 457 bp完整基因組,其GC 含量為40.3%。

2.3 基因組注釋與分析結果 (1)編碼基因預測結果:預測編碼基因數量2096,預測基因序列總長度2 047 410 bp；(2)重復序列預測結果:原核生物基因組中重復序列含量極少。本次測序菌株中預測出的重復序列總長度為4 739 bp,基因組中重復序列含量0.21%；(3)非編碼RNA 預測結果:非編碼RNA 即不編碼蛋白質的RNA,本次測序菌株中預測出19 個rRNA 非編碼數量,59 個tRNA 非編碼數量；(4)假基因預測:假基因是具有與功能基因相似的序列,但由于插入、缺失等突變以致失去了原有的功能。本研究得到的假基因數量為3,假基因總長度為736 bp。

2.4 牦牛巴氏桿菌比較基因組學分析

2.4.1 基因組共線性分析 將測序樣品的蛋白序列分別與每一個參考基因組的蛋白序列進行BLAST比對,然后根據同源基因在基因組序列上的位置信息得到核酸水平上的共線性關系分析,共線性良好。

2.4.2 基因家族與特有基因分析 共得到2 105個基因族。1 株測序菌株與2 株參考菌株共有的基因族類(核心基因族)有1 483 個,占總基因組的70.45%。分析同時只在兩株菌中共有的基因族發現,參考菌株Pasteurella multocida 與測序菌株Xizang Pasteurella 共有的基因族(394 個)明顯多于其他組合。本次分離菌株與參考菌株共有的功能1 964 個,分離菌株特有的基因數量有132 個。部分結果的統計信息和維恩圖見表1 和中插彩版圖1。

表1 基因家族分類統計

根據上述聚類的基因家族的結果,分別統計測 序菌株和參考菌株的菌株特有基因(菌株特有基因家族中的基因和未參與到上述聚類的基因之和),統計結果見表2。

表2 測序菌株和參考菌株的菌株特有基因統計

2.4.3 物種間進化關系分析 使用測序物種與參考物種均為單拷貝的基因家族中的基因,通過物種間進化分析顯示,與參考的Pasteurella multocida 較近。見圖2。

圖2 物種間進化關系分析

3 討論

本研究提取分離菌株的全基因組,通過SMRT測序,其基因組大小為2.3 Mb。使用Canu 軟件進行組裝,達到細菌基因組比較基因組分析要求。

在細菌的基因組中,基因在進化過程中可能會發生突變,導致原有的基因功能喪失而產生的一類基因,這類基因則被稱為假基因。我們利用已預測得到的蛋白序列與Swiss-Prot 數據庫中收錄的細菌的蛋白序列,通過軟件GenBlastA 比對,在基因組上尋找同源的基因序列(可能的基因),然后利用軟件GeneWise 尋找基因序列中的不成熟的終止密碼子及移碼突變,得到假基因。杜慧慧等[12]對不同毒力的牛源A 型Pm 菌株進行假基因預測,得出假基因數目越多其毒力相對較弱,反之假基因數目越少則毒力相對越強。本次得到假基因數目為3,數目相對較少,因此懷疑本次分離菌株毒力相對較弱。

本次測序的菌株和參考菌株(Mannheimia haeemolytica、Pasteurella multocica)基因組進行全基因組共線性分析,參考菌株與測序菌株之間共線性良好。

對測序菌株預測出的蛋白序列和參考基因組的蛋白序列進行家族分類,共得到2 105 個基因族。各個族在3 株菌種的分布如中插彩版圖1 所示,3株菌共有的基因族類(核心基因族)有1 483 個,占總基因組的70.45%。分析同時只在兩株菌中共有的基因族發現,Pasteurella multocida 與Xizang Pasteurella 共有的基因族(394 個)明顯多于其他組合。本次分離菌株與參考菌株共有的功能1 964 個,分離菌株特有的基因數量有132 個。

基因組學是當前生命科學領域最前沿的學科之一,是研究病原微生物的分子致病機理,篩選有效的免疫原性因子和藥物紀標等的基礎。本研究測序牦牛源巴氏桿菌全基因組序列,在基因組測序的基礎上,進一步開展編碼基因、重復序列、非編碼RNA、假基因等進行預測,最后對基因組共線性、基因家族與特有基因以及物種間進化關系分析,為牦牛巴氏桿菌病的防治提供新的思路。