山東省豬瘟Erns 基因系統進化分析與表達模式的研究

蘭鄒然，張 月，楚遵鋒，徐淑華，田夫林，王金寶

(1.山東省動物疫病預防與控制中心,山東 濟南250022；2.山東省農業廳,山東 濟南250002)

豬瘟(CSF)為黃病毒科瘟病毒屬成員,是嚴重危害養豬業的傳染病之一,傳染性很強,致死率較高,給養豬業造成巨大的經濟損失,世界動物衛生組織(OIE)將此病列為A 類傳染病之一[1]。世界上,包括亞洲、歐洲、中南美洲、部分非洲等許多國家采取了大規模的疫苗防控跟凈化措施,但是豬瘟仍然普遍存在[2]。20 世紀20 年代我國首次對該病進行了報道,此后的幾十年里,疫情接連不斷的發生。1954 年,Zhou 等[3]研發的豬瘟兔化弱毒疫苗雖然較好地控制了豬瘟在我國的廣泛流行,但20世紀70 年代末,我國包括山東省等多個省份仍就受到該病的危害。

豬瘟病毒為單股正鏈RNA 病毒,基因組大約12.5 kb,由一個大的ORF 編碼一個3 898 個氨基酸的多聚蛋白。該蛋白在細胞內蛋白酶和病毒特異性的蛋白酶作用下裂解成各種成熟的結構蛋白(S)和非結構蛋白(NS)。從N 端開始至C 端各蛋白質分別是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B。其中,Erns和E2 是其主要的保護性抗原,且Erns具有RNase 酶活性,成為研究抗豬瘟病毒藥物重要的靶基因[4]。

全球豬瘟流行性病學調查對研究豬瘟病毒的起源與消滅起很大的作用。過去,多數研究是針對E2 基因。臺灣的豬瘟的流行性病學調查指明Erns和E2 具有相似的系統進化樹,且Erns比E2 在進化上更保守些[5]。本研究就是想通過對Erns的研究,進一步揭示山東省豬瘟病毒在中國以及全球豬瘟病毒系統進化中地位。

1 材料與方法

1.1 菌種及質粒 E.coli Top10,購自生工生物工程(上海)股份有限公司；P.pastoris GS115 和P.pastoris 整合型分泌達質粒pPIC9K 由山東省農業科學院家禽研究所贈送。

1.2 試劑與工具酶 酵母完全培養基(YPD)、選擇培養基(MD)、甲醇選擇培養基(MM)、誘導培養基(BMGY)和甲醇誘導培養基(BMMY)按Invitrogen 公司說明書配制；Plasmid Miniprep kit 和Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 以及各種限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和T4 DNA 連接酶Ex taq 酶,購自TaKaRa 公司；Tryptone Yeast 為OXOID 產品；YNB 為Solarbio 產品。

DL-2 000 DNA Marker、低分子質量蛋白質Marker,購自 TaKaRa 公司；四甲基氨基甲烷(TEMED)D-山梨醇等,購自Promega 公司；過氧化物酶標記的二抗等為Sigma 公司產品；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 病毒和細胞 采集山東省疑似豬瘟病料,包括淋巴結、腎臟、脾臟等,用GenBank 公布的引物[6]HCV-1:5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′；HCV-2:5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′開展RT-PCR檢測。將檢測為陽性的病料按照Liu,J.J 的方法[12]接種PK-15 細胞。

1.4 RT-PCR 和Erns基因的克隆 取帶毒細胞液200 μL,參照TRLZol Reagent 試劑說明書進行總RNA 的提取,空氣中自然干燥。用疫苗毒和滅菌水做陽性和陰性對照。

Erns基因的DNA 合成參照TIANGEN 的Quant One Step RT-PCR Kit 說明書進行。Erns基因的特異性引物為E0-1:(5′-GAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′)； E0-2: 5′-ACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。PCR 反應體系為50 μL,反應條件為10×RT-PCR Buffer(5 μL),10 mmol/L dNTP Mixture each(2 μL),5×RT-PCR enhancer(10 μL),20 U RNasin,2.25 U Hotmaster Taq polymerase,Quant RTase for one step(0.5 μL),primer E0-1(10 μmol/L)(3 μL),primer E0-2(10 μmol/L)(3 μL),RNA(template)(1μg),ddH2O(23.5 μL)。一步法程序是:50 ℃(30 min),94 ℃(2 min),94 ℃(35 cycles 30 s),線性化53 ℃(30 s),延伸65 ℃(1 min),最終延伸65 ℃(10 min)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。

陽性PCR 產物用TIANGEN 公司的膠回收試劑盒回收并取4.0 μL 回收產物按TaKaRa 公司pMD18-T vector 說明書克隆入T 載體,經初步鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 序列與系統進化分析 分析測序結果,獲得Erns基因的全長cDNA 序列,并對該序列進行生物信息學的分析,例如信號肽和糖基化位點預測。此外該序列經NCBI BLAST 程序比對后,預測它的保守結構域,并尋找同源基因的存在。用DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序分析36 株參考毒株的蛋白質序列之間的相似性和趨異進化程度。序列比較的方法為CLUSTAL W 方法。采用Mega3.1 鄰接法(Neighbor-joining Method)構建了系統進化樹。利用TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件分析其是否含有跨膜區。

1.6 pPIC9K-Erns基因重組質粒構建 設計合成重組質粒的特異性引物并擴增Erns基因,在5′端加EcoR Ⅰ位點,3′端加NotⅠ位點,引物序列如下:E0-3:5′-CGGAATTCGAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′和E0-4:5′-ATTTGCGGCCGCACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。將Erns基因及pPIC9K 質粒載體均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶雙切,瓊脂糖電泳,回收酶切片段；將雙酶切后的Erns基因片段及pPIC9K 片段用T4 DNA 連接酶進行連接；連接產物轉化感受態Top 10(AMP+),用含AMP+的LB 平板篩選陽性重組子,通過酶切PCR 和測序等方法鑒定陽性克隆。

1.7 目的蛋白的誘導表達 將重組表達質粒pPIC9K-Erns和空質粒pPIC9K 用SalⅠ酶切線性化,將其電轉化到Pichi apastoris GS115 酵母感受態中,取400 μL 鋪于YPD 平板上,28 培養3 d 挑選生長良好的單菌落接種于2 mL YPD 培養過夜后,取新鮮的菌液3 μL 進行PCR 鑒定,選特異性引物:AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；AOX2:5′-GCAA ATGGCATTCTGACATCC-3′,陽性菌落再利用G418 對Mut 型進行篩選。

選取PCR 鑒定且經過篩選正確的重組菌接種至含10 mL YPD 培養基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)的試管中,30 ℃,200 r/min 振蕩培養過夜；次日以1%的比例(V∶V)接種至含100 mL BMGY 培養基(1.34%YNB、4×10-7生物素、10%甘油、1%酵母提取物、2%蛋白胨、5%甘油)的500 mL 三角瓶中,30 ℃,200 r/min 振蕩培養約24 h；離心并將菌體重懸于BMMY 培養基(1.34%YNB 4×10-7生物素、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇)中,28 ℃,200 r/min 振蕩誘導表達4 d,每隔24 h 補加100%甲醇至終濃度為0.5%,按時間段取樣進行分析。

將工程酵母菌在BMMY 培養基中誘導培養一定時間后,離心分別收集沉淀和上清,并將培養上清用硫酸銨沉淀法初步純化,用2 倍上樣緩沖液與沉淀和純化的上清蛋白等量混合進行SDS-PAGE 試驗,以分析目的蛋白的表達。

1.8 蛋白印跡(Western-Blot)檢測 將SDS-PAGE的電泳產物轉移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂乳封閉。用CSFV 陽性豬血清進行Western-Blot 檢測。

2 結果與分析

2.1 Erns基因擴增產物的鑒定 我們從山東省豬瘟病毒株 SDCQ 中得到了 Erns基因(序列號:JQ911701),該cDNA 克隆全長為696 bp(圖1),編碼一個232 個氨基酸的蛋白質,其理論分子量為50 kDa。其蛋白質具有RNA 酶的活性,包含一個RNase T2 結構域。

圖1 Erns基因的片段擴增

2.2 序列與系統進化分析 經NCBI 里的BLAST 和SMART program(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析發現,該cDNA 編碼的蛋白質比較保守,有RNase T2 保 守 結 構 域。 TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件分析表明,Erns不具有跨膜區。對SDCQ 株Erns基因編碼的蛋白與其他36 株參考毒株的Erns基因編碼的蛋白進行系統進化分析發現:這些毒株分為兩個基因群,4 個亞群(圖2),SDCQ 株屬于Subgroup 1.1a,此亞群是有德國株Paderborn、3 個臺灣毒株和7 個國內株組成的,同源性在93%～99%之間,由此可以推測該亞群病毒擁有共同的祖先；與Subgroup 1.1b的同源性在91%～92%之間；而與Group2 中參考序列的同源性比較在84%～86%之間(見圖2)。五個疫苗株:LPC/AHRI(Taiwan),HCLV(China),Riems(Holland),Chinese C strain 和Chinese vaccine strain 聚集在一起,與Pan 等[5]之前研究得出的結論一致。值得注意的是,SDCQ 并沒有與國內外經典的具有代表意義的毒株聚集在一起,由此可知,山東省內流行的CSFV 毒株與傳統強毒株和疫苗用毒株在主要抗原編碼基因上存在一定差異。

圖2 36 株CSFV Erns基因系統進化樹

分析SDCQ 和其他19 個參考毒株的氨基酸序列,Erns具有兩個保守區(CRs),分別位于aa 28 ～36和75 ～82 區域(圖3)。流行毒株與疫苗株在CR1 區域存在差異,位于36 位點的氨基酸E 被G 所取代。由此引出一個有趣的問題:此變化是否帶來毒力的變化?序列中位于30 位和79 位的H(組氨酸)為RNase 催化活性關鍵氨基酸殘基,此位點高度保守[6]。

2.3 pPIC9K/Erns重組質粒與重組酵母菌的篩選

對重組質粒進行PCR 和雙酶切鑒定。PCR 結果顯示,有與目的基因相符的696 bp 大小的條帶；然后雙酶切其質粒,電泳結果顯示兩條帶,分別為9 kp 左右和696 bp(圖4A),陽性質粒測序結果證明,Erns基因已正確插入pPIC9K 的多克隆位點上。

將電轉化后的菌落作為模板,AOX1 和AOX2為引物,進行PCR 檢測,電泳結果顯示1 173 bp 大小的條帶(圖4B),與目的產物大小相符,陽性重組菌測序結果證明,pPIC9K/Erns重組質粒正確整合入酵母菌中。

圖3 20 株CSFV Erns氨基酸序列分析

圖4 重組質粒與重組菌的鑒定

2.4 Erns基因表達產物的SDS-PAGE 和Western Blot 分析 將篩選的轉化子分別接種BMGY 和BMMY 培養基誘導表達后,將表達上清透析、濃縮后進行SDS-PA GE 結果顯示,GS115/ pPIC9K-Erns轉化子誘導產物在50 kD 處出現與預計的以同源二聚體形式存在的Erns大小相符的條帶(圖5A),與Western-Blot 結果顯示一致(圖5B),重組蛋白Erns可被CSFV 多抗血清識別,且顯示兩條雜交條帶。這一結果與van Gennip 等[7]研究結果相吻合。

圖5 表達產物SDS-PAGE 電泳及Western-Blot 分析

3 討論

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性接觸傳染性病毒病,對養豬業危害嚴重。豬瘟病毒是一種具有囊膜的單股正鏈RNA 病毒,屬于黃病毒科瘟病毒屬。 其基因組包含一個大的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),編碼一種由約3 898 個氨基酸殘基組成的多聚體蛋白,該多聚體蛋白在病毒和細胞酶作用下加工成4 種結構蛋白(C、Erns、E1、E2)和8 種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)。

Erns是豬瘟病毒所有蛋白中比較特殊的一種囊膜糖蛋白,只存在于黃病毒科的瘟病毒屬,是一種高度糖基化的蛋白。糖蛋白分子量約占Erns總蛋白分子量的二分之一。在感染細胞中Erns在內質網內積累,并可存在于病毒粒子表面或被分泌到胞外。所以,Erns蛋白很難在常用的細菌系統中獲得有活性的蛋白。畢赤酵母(Picha pastoris)是一種甲醇營養型酵母,能夠在以甲醇作為單一碳源的培養基上生長,既具有原核生物易于培養、繁殖快、便于基因工程操作的特點,又具有真核生物的蛋白質加工、折疊、翻譯后修飾的優點,同時其遺傳比較穩定,能夠密度發酵,蛋白的表達量高、且易于純化,因此,畢赤酵母現已成為現代分子生物學研究最重要的工具和模型,是表達外源基因比較理想的宿主。

本試驗從山東省豬瘟病毒株SDCQ 中擴增到了Erns基因全長696 bp,通過構建系統進化樹發現SDCQ 并沒有與國內外經典的具有代表意義的毒株聚集在一起,由此可知,山東省內流行的CSFV 毒株與傳統強毒株和疫苗用毒株在主要抗原編碼基因上存在較大差異。序列分析發現,流行毒株與疫苗株在CR1 區域存在差異,位于36 位點的氨基酸E 被G 所取代,是否因此帶來毒力的變化,還需進一步證實。通過構建pPIC9K-Erns重組質粒,成功轉化和篩選到一株多拷貝的工程酵母菌,通過甲醇誘導培養分泌表達了一定量的Erns蛋白。Western-Blot 分析結果表明,表達的Erns蛋白能識別天然豬瘟多克隆抗體,具有生物學活性,同時證實Erns是以同源二聚體的形式存在。下一步試驗將大量誘導Erns蛋白,收集表達產物,經過純化以期得到高產量蛋白,為基因工程疫苗和檢測試驗的研究奠定基礎。