金感膠囊微生物限度檢查方法適用性研究

滕 鈺 徐 洪 周映佑 羅 曼 薛詠蘭 黃 婕 王 俊

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施[1]。藥品一旦受到微生物污染，將造成藥品變質、成分分解失效甚至產生毒素，引起疾病、威脅生命[2]。微生物限度檢查不僅能正確地反映藥品企業生產工藝及處方比例的合理性及科學性，也是保證藥品質量的重要手段[3]。

金感膠囊為獨家生產品種，處方組成為金銀花、穿心蓮、板藍根、蒲公英、對乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺、馬來酸氯苯那敏，具有清熱解毒，疏風解表的功效[4]。目前還未見相應微生物限度檢查方法的報道。本文按《中國藥典》要求，依照品種特性，建立了適宜的微生物檢查方法，以補充該品種的在微生物質量控制方面的空缺。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1300生物安全柜(賽默飛世爾)；ME2002電子天平(梅特勒-托利多)；KB240低溫培養箱(BINDER)；BF240恒溫培養箱(BINDER)；DK-98-ⅡA水浴鍋(天津泰斯特)。

1.2 樣品 金感膠囊(批號：20161104、20161116、20170619，貴州百靈企業集團制藥股份有限公司)。

1.3 菌種 黑曲霉(CMCC(F)98003)、白色念珠菌(CMCC(F)98001)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)、大腸埃希菌(CMCC(B)44102)等均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養基 麥康凱瓊脂培養基(批號：1604055)、胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA(批號：18042762)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基SDA(批號：18010864)、沙氏葡萄糖液體培養基SDB(批號：18073161)等購自北京陸橋技術股份有限公司；胰酪大豆胨液體培養基TSB(批號：18030915)、麥康凱液體培養基(批號：20180828)等購自北京三藥科技開發公司。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取“1.3”項下菌種，按2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106“菌液制備”項下進行[5]。

2.2 供試液制備 稱取批號為20161104的樣品10 g，加入TSB至100 mL，40℃水浴保溫混勻，即得1∶10供試液。取3份稀釋倍數為1∶10供試液(10 mL)，分別加入TSB至50 mL、80 mL、100 mL，即得1∶50、1∶80、1∶100稀釋倍數供試液。

2.3 預試驗

2.3.1 計數方法[5]試驗組：取1∶10、1∶50、1∶80、1∶100供試液，分別加入“2.1”項下制備的黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌，混合，使得每mL供試液中對應菌濃度不大于100 cfu。分別取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌與供試液混合液平行注皿，傾注20 mL TSA，33 ℃培養3 d計數；分別取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌與供試液混合液平行注皿，傾注20 mL SDA，23 ℃培養5 d計數。供試液對照組：不加菌液，其余按“試驗組”制備菌液組：不加供試液，其余按“試驗組”進行。回收比值=(試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組，其范圍應為0.5～2。

2.3.2 計數方法預試驗結果 按“2.3.1”操作所得結果如表1所示，表明該品種對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌有抑制作用。其中抑制白色念珠菌的生長較明顯：當供試液稀釋倍數為1：50時，白色念珠菌在TSA和SDA培養基上的回收比值均小于0.5，不符合《中國藥典》規定；當需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗環節的供試液稀釋倍數分別為1∶100、1∶80時，白色念珠菌的回收比值為0.73、0.91，能夠達到藥典要求，故選擇上述稀釋倍數進行正式試驗。

表1 金感膠囊計數方法預試驗結果

2.3.3 控制菌檢查方法[5]取10 mL 1∶10供試液，分別接種至100 mL、150 mL、200 mL TSB中，加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，混勻，33 ℃培養18 h。取1 mL培養物至100 mL麥康凱液體中，43 ℃培養24 h后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，33 ℃培養18 h，以上即為試驗組。同法制備陽性對照組，對比觀察菌落形態。

2.3.4 控制菌檢查方法預試驗結果 由表2可知，方法適用性試驗的所有體積均能檢出相應陽性菌，故選擇TSB 100 mL作為正式試驗TSB培養基體積。

表2 金感膠囊控制菌檢查預試驗結果

注：“+”表示有典型菌落生長

2.4 正式試驗

2.4.1 計數方法 需氧菌、霉菌和酵母總數計數分別采用1∶100供試液、1∶80供試液，按“2.3”項下操作進行。由表3可知，回收比值均大于0.5，符合藥典規定。

2.4.2 控制菌檢查[5]以TSB培養基體積 100 mL，按“2.3.3”項下操作，即得試驗組和陽性對照組。另取10 mL 1∶10供試液，接種至100 m TSB中，混勻，33 ℃培養24 h。取1 mL培養物至100 mL麥康凱液體中，43 ℃培養48 h后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，33 ℃培養72 h，即得供試品對照組。培養結束后，試驗組和陽性對照組均檢出大腸埃希菌，供試品對照組未檢出大腸埃希菌。

表3 金感膠囊計數方法適用性試驗結果

3 討論

研究中，霉菌和酵母菌計數時供試液稀釋倍數小于需氧菌總數計數的，但其對應的白色念珠菌回收比值高于需氧菌計數環節，且差別較大。除去培養溫度、培養時間的原因外，可能還與培養基差別有關。資料顯示，沙氏葡萄糖瓊脂培養基中葡萄糖含量高、pH值5.6左右，有利于霉菌和酵母菌的檢出[6]。經測，本研究所涉及的胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基滅菌后pH值分別為7.29、5.57，與解慧等[7]的研究數據接近。而白色念珠菌最適生長pH為5.0左右[8]，因此沙氏葡萄糖瓊脂培養基的pH值更適合白色念珠菌生長。

另外，沙氏葡萄糖瓊脂培養基的氮源是動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物，胰酪大豆胨瓊脂培養基中氮源為胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物。兩者氮源類別的區別在于前者配方中是動物性蛋白質來源水解物，后者則為植物性蛋白質來源水解物；植物性蛋白質如大豆的水解物往往會缺少某些微生物必需的氨基酸[9]。這可能是白色念珠菌在胰酪大豆胨瓊脂上回收比值更低的原因。

微生物限度檢查方法直接影響檢驗結果及藥品評價的準確性[10]。建立微生物限度檢查方法時，要考慮藥品所含成分的抑菌性[11]。金感膠囊的特殊之處在于其處方中既有中藥成分，也有西藥成分。品種成分中，除了有金銀花會抑制白色念珠菌的明確報道外[12]，馬來酸氯苯那敏成分可能會降低白色念珠菌的回收比值[13]，此外未見關于其它組分抑菌性的報道；但本研究發現樣品會對枯草芽孢桿菌的生長產生抑制，并不能明確是何種組分造成的影響，因此可對其它組分的抑菌性進行進一步研究。