醒腦靜注射液溶血性研究

云南省食品藥品監督檢驗研究院，云南 昆明 650000

醒腦靜注射液是一種常用的復方中藥急救制劑，是由傳統名方“安宮牛黃丸”改制而成的新型水溶性中藥注射液，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦的作用，靜脈注射后可通過血腦屏障直接作用于中樞神經系統[1]。隨著中藥注射劑在臨床應用愈來愈廣泛，出現了諸多不良反應事件，使中藥注射劑的安全有效性和全面質量控制引起了社會的廣泛關注[2]，醒腦靜注射液作為急癥用藥不良反應也是屢見不鮮[3]。溶血與凝聚作為評價注射劑安全性的重要指標之一，在醒腦靜注射液現行的質量標準中未收載[4]。對于注射劑溶血項目的檢測，《中國藥典》 2015 年版規定采用肉眼觀察法對注射劑的溶血進行檢測和判定[5]，此方法簡便、易行，適于溶血明顯的樣品，但對于溶血不明顯或肉眼無法判定的情況，檢驗人員的主觀誤差影響較大。為了更加準確的判斷結果，需要尋找一種更有效、 簡便的方法。根據《藥物研究技術指導原則》[6]以及文獻報道[7-8]，對于注射劑溶血的檢測，有紅細胞計數法、 紫外分光光度法、 體內溶血試驗法以及乳酸脫氫酶活性測定法。結合注射劑生產企業實驗室的情況和判斷的準確性，筆者采用肉眼觀察法和紫外分光光度法對醒腦靜注射液的溶血與凝聚進行系統性考察。

1 材料與儀器

1.1 材料 34批醒腦靜注射液，A藥業15批，B藥業4批，C藥業15批；規格：5 mL、2 mL、10 mL；氯化鈉注射液批號：C181219A，昆明南疆制藥有限公司產品。

1.2 試驗動物 家兔，體重2.5～3.0 kg。

1.3 儀器 TGL-16M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司； UV-2550PC分光光度計，日本島津；Grant SUB28恒溫水浴,Grant Instruments (Cambridge)Ltd； ZH-2型旋渦混合器，天津藥典標準儀器廠。

2 試驗方法

2.1 紅細胞懸液的制備 每次取兔心臟血約10 mL，置含玻璃珠的燒杯中振搖約10 min，除去纖維蛋白原使成脫纖血液，加入約10倍量氯化鈉注射液，搖勻，1500 r·min-1離心15 min，棄上清液，沉淀的紅細胞再用氯化鈉注射液同上法洗滌3次，上清液不顯紅色。取沉淀紅細胞4 mL用氯化鈉注射液稀釋至200 mL,配成2%的紅細胞懸液供試驗用，用時搖勻。

2.2 供試液的制備 根據“注射劑安全性檢查法應用指導原則”中對“溶血與凝聚檢查法中設定限值”的規定，應以無溶血和凝聚的最大濃度的1/2作為限制濃度，如果注射劑原液無溶血和凝聚反應則以原液濃度為限值。本試驗分別以醒腦靜注射液原液、氯化鈉注射液稀釋的2倍、5倍稀釋液為供試液，研究醒腦靜注射液的溶血性。

2.3 試驗方法

2.3.1 肉眼觀察法 每1批樣品取潔凈試管3支編號，1、2號管為相應的供試液管，3號管為供試品對照管，另取2支試管編號為4號管和5號管，分別為陰性對照管、陽性對照管。按表1所示依次加入2%紅細胞懸液、氯化鈉注射液、蒸餾水及供試品，立即混勻，置(37±0.5)℃恒溫水浴中保溫，3h后觀察溶血和凝聚反應。按表2標準肉眼判斷有無溶血與凝聚現象出現。

2.3.2 按2.3.1項下方法 進行處理樣品后，各管1500 r·min-1離心15 min，取上清液，置紫外分光光度儀中，在200～800 nm波長間掃描，結果顯示在545 nm波長處有最大吸收。以氯化鈉注射液為陰性對照，蒸餾水為陽性對照，測定各管的OD值，按公式[溶血率(%)=(供試品管OD值-陰性對照管OD值)/(陽性對照管OD值-陰性對照管OD值)×100%]計算溶血率，以溶血率>5%表示有溶血發生。

表1 醒腦靜注射液溶血與凝聚試驗加樣表

表2 溶血與凝聚肉眼觀察判斷標準

3 試驗結果

分別以3個廠家的原液、2倍稀釋液、5倍稀釋液為檢查濃度，進行溶血與凝聚檢測，用肉眼觀察和紫外分光光度的方法觀察判斷樣品溶血與凝聚現象。

表3 A藥業樣品分光光度法溶血率/%

表4 B藥業樣品分光光度法溶血率/%

表5 C藥業樣品分光光度法溶血率/%

溶血率表示溶血發生的程度，大于5%即表示溶血發生。從表3、表4和表5可以看出，34批樣品用分光光度法判斷溶血，原液均引起溶血，C藥業的溶血率為80%～100%，A藥業及藥業的溶血率為40%～80%。樣品在2倍稀釋液時，其中20批有溶血現象發生，樣品在5倍稀釋液時，所有樣品都未有溶血現象發生。將34批樣品的肉眼觀察法和紫外分光光度法的溶血結果進行對比，結果見表6。

表6 肉眼判斷和分光光度法判斷對比

注：+表示有溶血現象發生，-表示無溶血現象發生

從表6 可以看出，34批樣品以原液和5倍稀釋液為檢查濃度時，肉眼觀察和紫外分光光度法判斷的結果是一致的，都沒有溶血現象發生。以2倍稀釋液為檢查濃度時，肉眼判斷有14批發生溶血，分光光度法判斷有20批發生溶血，兩者判斷有差異的6批樣品的紫外分光光度測定的溶血率大致在5%～15%之間，肉眼觀察很難發現。

4 討論

本法是將一定量供試液與2%兔紅細胞混懸液混合，溫育一定時間后，觀察其對紅細胞的溶血與凝聚反應以判定供試品是否符合規定。供試品不合格表明注射劑中污染超過正常存在的溶血性物質，或污染致血細胞凝聚，臨床用藥后將可能產生有關不良反應。溶血與凝聚作為評價注射劑安全性的重要指標之一，在醒腦靜現行標準中未收載，因此建議應對醒腦靜注射液的現行標準進行提高，并增加溶血與凝聚檢查項。

實驗結果表明，相同廠家、不同批次以及不同廠家間的醒腦靜注射液在溶血性方面存在較大的差異。對于相同廠家的醒腦靜注射液，生產工藝相對穩定，差異可能來自原輔料來源的穩定性，原料藥及輔料來源不同其中所含各組分的比例及雜質成分都可能有差異，中藥材的產地、采收期不同也會對中藥注射劑的質量不穩定性產生很大影響。對于不同廠家的醒腦靜注射液，受生產工藝和原輔料的來源不同等多重因素影響[9]，造成差異進一步加大。醒腦靜注射液的主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子，輔料為聚山梨酯80和氯化鈉。據了解，C廠家在生產該品種時使用了天然麝香和天然冰片，而A、B廠家使用的是人工麝香和人工冰片，據文獻報道，不同廠家、不同濃度的麝香[10]和冰片[11]溶血作用有明顯差異，人工的和麝香、冰片之間的溶血性差別有待進一步試驗驗證。醒腦靜注射液的輔料聚山梨酯80中的山梨醇、山梨醇酐和異山梨醇酐3種成分也均具有溶血性[12-13]。

同時，筆者從試驗結果發現，在2倍稀釋液檢查溶血時，肉眼判斷有14批溶血，而分光光度法則判斷有20批溶血，其中6批分光光度法判為溶血的溶血率為5%～15%，肉眼觀察沒有發現，當用2倍稀釋液作為限值時，若有目測法會引起漏判。而紅細胞破裂釋放出來的血紅素在可見光波長段具有最大吸收，采用分光光度法測定中藥注射劑的溶血程度，具有準確、操作簡便，穩定性好，能消除常規試管法帶來的主觀誤差等缺點,故判斷結果時建議采用分光光度法。