液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中氯霉素類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的方法

張 佳 王 丹 關(guān)婷婷 成林林 張慧利

（焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心，河南焦作 454000）

1 方法原理

樣品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液濃縮干后，殘?jiān)眉状既芤喝芙猓?jīng)正己烷液液分配脫脂，液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 試劑、材料與溶液

除特別注明外，以下所用試劑均為分析純：水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氯苯尼考（FF）、氯苯尼考胺（FFA）；內(nèi)標(biāo)物：氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3（FFA-D3）；甲醇色譜純；乙腈色譜純；氨水；乙酸乙酯；正已烷；甲酸銨；微孔濾頭孔徑0．22μm。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。-20℃冰箱中保存。內(nèi)標(biāo)貯備液取氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液。-20℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為1μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作，從中取1ml，置10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋成濃度為100 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

混合內(nèi)標(biāo)中間工作液：準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)貯備液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為1μg/ml的混合內(nèi)標(biāo)工作液，從中取1ml，置10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋成濃度為100ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)中間工作液。

3 儀器與設(shè)備

液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）美國(guó)Water公司W(wǎng)aters UPLC TQ－S；天平感量0.01g；分析天平感量0.0001g；組織勻漿機(jī)；渦旋混合器；振蕩器；離心機(jī)；氮吹儀；移器；聚四氯乙烯離心管（50ml）。

4 方法步驟

4.1 試樣的制備與保存

取適量新鮮或冷凍的空白或供試組織，絞碎并使均勻。

試劑空白不加試樣外，與待測(cè)試樣同步處理。

空白樣品取空白試樣，與待測(cè)試樣同步處理。

添加樣品取空白試樣5g，添加100ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.05ml，制得濃度為1μg/kg的陽(yáng)性添加試料，與待測(cè)試樣同步處理。

4.2 提取

稱(chēng)取試樣5土0.02g，置于50ml離心管中，加入100 ng/ml混合內(nèi)標(biāo)工作溶液50μl，加入氨水0.5ml，乙酸乙酯15ml，渦旋振蕩提取15min，14000 r/min離心5min。用吸管吸取上層液體于另一個(gè)50ml離心管中。殘?jiān)靡宜嵋阴?0ml重復(fù)提取一次，合并提取液，于50～60℃水浴氮?dú)饣蚩諝獯蹈伞?/p>

4.3 凈化

加入20%甲醇溶液1mL，渦旋混合使溶解。再加入正己烷2ml，輕搖脫脂，14000r/min離心或靜止使分層，將下層液體轉(zhuǎn)移至15ml進(jìn)口尖底離心管中，2000r/min離心10min。用注射器小心吸取離心后的清液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，供液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

5 儀器參數(shù)與測(cè)定

色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）

柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：乙腈：B：10 mmol/L甲酸銨溶液，進(jìn)樣量：5L；離子源：電噴霧ESI；掃描方式：負(fù)離子掃描/正離子掃描；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM

電離電壓：負(fù)離子模式3．0kV，正離子模式15kV；

錐孔電壓：負(fù)離子模式20V，正離子模式8V；

源溫：150℃；霧化溫度：500℃；錐孔氣流速：150Lh；

霧化氣流速：1000Lh

6 結(jié)果計(jì)算

采用單點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法校正，按下式計(jì)算：

校正因子按下列公式計(jì)算

供試組織中氯霉素類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物殘留量按下列公式計(jì)算

計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。

7 結(jié)果

本方法中氯霉素在動(dòng)物源食品中的檢測(cè)限為0.1μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在動(dòng)物源食品中的檢測(cè)限為1μg/kg。本方法在0.2～10μg/kg添加濃度的回收率為70～120%。