液相色譜－串聯質譜法測定動物源食品中氯霉素類藥物及其代謝產物殘留的方法

張 佳 王 丹 關婷婷 成林林 張慧利

（焦作市畜產品質量安全監測中心，河南焦作 454000）

1 方法原理

樣品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液濃縮干后，殘渣用甲醇溶液溶解，經正己烷液液分配脫脂，液相色譜一串聯質譜儀測定，采用內標法定量。

2 試劑、材料與溶液

除特別注明外，以下所用試劑均為分析純：水為符合GB/T 6682規定的一級水；標準品：氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氯苯尼考（FF）、氯苯尼考胺（FFA）；內標物：氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3（FFA-D3）；甲醇色譜純；乙腈色譜純；氨水；乙酸乙酯；正已烷；甲酸銨；微孔濾頭孔徑0．22μm。

標準貯備液：取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯苯尼考胺標準品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/ml的標準貯備液。-20℃冰箱中保存。內標貯備液取氯霉素D5（CAP-D5）、甲砜霉素D3（TAP-D3）、氯苯尼考D3（FF-D3）、氟苯尼考胺D3標準品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋成濃度為100μg/ml的內標貯備液。-20℃冰箱中保存。

混合標準中間工作液：準確量取標準貯備液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為1μg/ml的混合標準工作，從中取1ml，置10ml量瓶中，用流動相稀釋成濃度為100 ng/ml的混合標準中間工作液。

混合內標中間工作液：準確量取內標貯備液各0.1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為1μg/ml的混合內標工作液，從中取1ml，置10ml量瓶中，用流動相稀釋成濃度為100ng/ml的混合內標中間工作液。

3 儀器與設備

液相色譜一串聯質譜儀（配電噴霧離子源）美國Water公司Waters UPLC TQ－S；天平感量0.01g；分析天平感量0.0001g；組織勻漿機；渦旋混合器；振蕩器；離心機；氮吹儀；移器；聚四氯乙烯離心管（50ml）。

4 方法步驟

4.1 試樣的制備與保存

取適量新鮮或冷凍的空白或供試組織，絞碎并使均勻。

試劑空白不加試樣外，與待測試樣同步處理。

空白樣品取空白試樣，與待測試樣同步處理。

添加樣品取空白試樣5g，添加100ng/ml的混合標準中間工作液0.05ml，制得濃度為1μg/kg的陽性添加試料，與待測試樣同步處理。

4.2 提取

稱取試樣5土0.02g，置于50ml離心管中，加入100 ng/ml混合內標工作溶液50μl，加入氨水0.5ml，乙酸乙酯15ml，渦旋振蕩提取15min，14000 r/min離心5min。用吸管吸取上層液體于另一個50ml離心管中。殘渣用乙酸乙酯10ml重復提取一次，合并提取液，于50～60℃水浴氮氣或空氣吹干。

4.3 凈化

加入20%甲醇溶液1mL，渦旋混合使溶解。再加入正己烷2ml，輕搖脫脂，14000r/min離心或靜止使分層，將下層液體轉移至15ml進口尖底離心管中，2000r/min離心10min。用注射器小心吸取離心后的清液，過0.22μm微孔濾膜，供液相色譜一串聯質譜儀測定。

5 儀器參數與測定

色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）

柱溫：30℃；流動相：A：乙腈：B：10 mmol/L甲酸銨溶液，進樣量：5L；離子源：電噴霧ESI；掃描方式：負離子掃描/正離子掃描；采集模式：多反應監測MRM

電離電壓：負離子模式3．0kV，正離子模式15kV；

錐孔電壓：負離子模式20V，正離子模式8V；

源溫：150℃；霧化溫度：500℃；錐孔氣流速：150Lh；

霧化氣流速：1000Lh

6 結果計算

采用單點內標法校正，按下式計算：

校正因子按下列公式計算

供試組織中氯霉素類藥物及其代謝產物殘留量按下列公式計算

計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數字。

7 結果

本方法中氯霉素在動物源食品中的檢測限為0.1μg/kg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在動物源食品中的檢測限為1μg/kg。本方法在0.2～10μg/kg添加濃度的回收率為70～120%。