不同促排卵方案對小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

陳艷婷，王玉林，袁秋虹，鄧偉民，郭新宇 *

(1.中國人民解放軍南部戰區總醫院中西醫結合科，廣州 510010；2.廣州中醫藥大學，廣州 510405；3.廣州中醫藥大學順德醫院內三科，佛山 528333)

隨著IVF-ET的發展，促排卵技術作為IVF-ET的關鍵環節也趨向多樣化、個體化發展。促排卵技術主要是在外源性的人為激素的干預下，通過增強或改善卵巢自身的內分泌及排卵功能，以獲取多個卵母細胞，為提高IVF-ET的成功率創造機會。但促排卵過程中，非生理劑量促性腺激素的運用，最終導致體內的雌激素超出生理水平[1]，高于生理水平的雌激素是否影響卵泡及胚胎質量還未得出一致結論[2]。卵泡是卵巢的基本結構和功能單位，在卵泡發育成熟過程中，顆粒細胞的增殖、分化對卵泡的發育有著重要的作用。顆粒細胞的凋亡可抑制卵母細胞及卵泡的發育，促進卵泡閉鎖。因此，本研究模擬臨床不同促排卵方案建立小鼠模型，通過觀察不同促排卵方案對小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，以探討不同促排卵方案對卵泡質量的影響。

材料與方法

一、藥物、試劑與儀器

醋酸曲普瑞林注射液(GnRH-a，輝凌，瑞士)；注射用醋酸西曲瑞克(GnRH-ant，Pierre Fabre，法國)；注射用血促性素(PMSG，Prospecbio，以色列)；人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠醫藥)。兔抗小鼠Fas抗體(ab82419，Abcam，英國)，兔抗小鼠FasL抗體(af0157，Affnity Biosciences，美國)，兔抗小鼠Caspase-8抗體(ab25901，Abcam，英國)，兔抗小鼠Caspase-3抗體(bs-0081R，北京博奧森)，山羊抗兔鼠通用二抗(GK500705，上海基因，)，包埋機(JB-P5，武漢俊杰電子)，病理切片機(RM2016，上海徠卡儀器)，倒置熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE TI-SR，尼康，日本)。

二、研究方法

1．實驗動物及分組：SPF級KM雌性小鼠40只，6～8周齡，體重20～25 g(實驗動物由中國人民解放軍南部戰區總醫院動物實驗中心提供，合格證號：44007200046941)。適應性飼養1周后進入實驗階段，隨機分為4組：孕馬血清促排卵組(PMSG組)、促性腺激素釋放激素激動劑組(GnRH-a組)、促性腺激素釋放激素拮抗劑組(GnRH-ant組)、自然排卵組(空白對照組)，每組10只。

2.各組小鼠具體促排卵方案及操作如下[3-4]：GnRH-a組：小鼠于陰道涂片為動情后期(動情周期第3天)時，每日9：00 am 腹腔注射醋酸曲普瑞林20 μg/kg，連續9 d，第9天同時腹腔注射PMSG 400 U/kg，48 h 后腹腔注射HCG 1 000 U/kg；GnRH-ant組：GnRH-ant組小鼠以醋酸西曲瑞克注射液400 U/kg代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組；PMSG組：PMSG組小鼠以等體積生理鹽水代替GnRH-a腹腔注射，其余處理同GnRH-a組。空白對照組：空白對照組小鼠每日給予等體積生理鹽水腹腔注射，連續11 d。

各組小鼠于最后一次腹腔注射2 h后頸椎脫臼處死，快速取出雙側卵巢，其中一側卵巢經4%多聚甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋，切片(4 μm)；另一側卵巢置于-80℃冰箱凍存。

3.檢測指標與方法：免疫組化檢測各組小鼠卵巢組織中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的表達。石蠟切片脫蠟至水，切片浸泡于裝滿EDTA抗原修復緩沖液的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，加一抗過夜，加二抗孵育，切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間(一般在2 min以內)，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。用蘇木素復染細胞核，最后脫水封片。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對各組小鼠卵巢組織中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的蛋白表達進行半定量分析，以平均光密度值(IOD)表示結果，陽性細胞的表達越強，IOD值越大。

三、統計學分析

結 果

各組小鼠經不同促排卵方案干預后，卵巢顆粒細胞免疫組化Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達水平總體趨勢為：GnRH-a組/GnRH-ant組>空白對照組>PMSG組。其中，PMSG組小鼠卵巢顆粒細胞凋亡因子Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達低于空白對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)；GnRH-a組與GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表達顯著高于空白對照組(P<0.05)(圖1～4，表1)。

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對照組；箭頭示卵泡圖2 小鼠卵巢顆粒細胞FasL的表達(免疫組織化學,×40)

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對照組；箭頭示卵泡圖3 小鼠卵巢顆粒細胞Caspase8的表達(免疫組織化學,×40)

A：PMSG組；B：GnRH-a組；C：GnRH-ant組；D：空白對照組；箭頭示卵泡圖4 小鼠卵巢顆粒細胞Caspase3的表達(免疫組織化學,×40)

組 別例數FasFasLCaspase8Caspase3PMSG組1034.58±9.9021.24±2.3721.19±1.2320.01±5.19GnRH-a組1070.93±8.26#43.82±4.01#76.47±6.80#49.60±8.04?GnRH-ant組1078.83±8.54#37.35±4.90?78.10±6.06#58.59±9.54#空白對照組1036.10±2.7824.29±6.2122.28±3.1728.11±2.01

注：與空白對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

討 論

卵泡發育是由原始卵泡啟動生長的，依次發育為初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡和成熟卵泡。在卵泡發育過程中，顆粒細胞的生長啟動早于卵母細胞，提示顆粒細胞的變化可作為卵泡生長啟動的信號，也說明顆粒細胞的生長和分化可能是原始卵泡啟動發育的關鍵。作為卵巢的主要功能細胞之一，顆粒細胞具有支持和營養卵母細胞的作用，在卵泡發育過程的不同階段，顆粒細胞接受來自生殖軸神經內分泌和卵巢自分泌、旁分泌的調控而發生增殖或凋亡，是影響生殖功能的重要一環。細胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機制[5-8]，它所累及的主要是顆粒細胞的凋亡[9]。Wallace等[10]研究認為，卵母細胞質量與卵泡液中代謝產物有關，而卵泡液中多種細胞因子及激素的產生主要依賴于顆粒細胞。如果顆粒細胞大量凋亡，將引起卵泡內局部環境變化，干擾正常卵泡發育，導致卵巢病理性改變，并直接影響 IVF-ET 結局與妊娠成功率。所以顆粒細胞是一個較好的評價卵巢功能及卵泡質量的系統[11]。Fas 通路是經典細胞凋亡通路之一，以Fas系統為代表的死亡受體信號轉導途徑是卵巢顆粒細胞凋亡的重要途徑之一[12-14]，由Fas介導的細胞凋亡信號通路Fas-FasL-Caspase8-Caspase3的激活最終導致細胞凋亡不可逆的發生。

研究表明，GnRH-a方案對人顆粒細胞及豬卵巢顆粒細胞均有直接的促凋亡作用[15-16]。Giampietro等[17]通過對卵巢儲備功能正常的婦女卵巢顆粒細胞的研究發現，GnRH-ant方案可導致顆粒細胞凋亡率的上升及凋亡相關基因表達的增加。并且有研究發現[18]，GnRH-a方案與GnRH-ant方案治療后婦女卵巢顆粒細胞凋亡水平相當，兩種方案對顆粒細胞的凋亡率無明顯差異。本研究中，GnRH-a組和GnRH-ant組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表達水平均較空白對照組升高，說明GnRH-a方案和GnRH-ant方案促進小鼠卵巢顆粒細胞Fas細胞凋亡信號通路各凋亡因子的表達，促進了小鼠顆粒細胞的凋亡，而GnRH-a組和GnRH-ant組兩組間凋亡水平無明顯差異，與以上研究結果基本一致。研究表明，PMSG方案具有抑制卵泡閉鎖以及顆粒細胞凋亡的作用，可促進卵泡重新生長發育成熟[19]，增加卵母細胞的蛋白質合成能力[20]，提高卵母細胞體外發育潛能[21]。本研究中PMSG組小鼠卵巢顆粒細胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表達水平均較空白對照組降低，說明PMSG方案可以下調Fas通路上各凋亡因子的表達水平，抑制小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，并使其接近自然排卵小鼠狀態。

總之，不同促排卵方案對小鼠顆粒細胞凋亡的影響不同，GnRH-a方案和GnRH-ant方案促進小鼠卵巢顆粒細胞Fas細胞凋亡信號通路各凋亡因子的表達，促進小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡；PMSG方案則下調Fas通路上各凋亡因子的表達水平，抑制小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡。鑒于顆粒細胞與卵泡質量的密切關系，推測GnRH-a方案和GnRH-ant方案對卵泡發育有一定程度的不利影響，PMSG方案可在一定程度促進卵泡發育。